硫化氢（H2S）含量检测试剂盒说明书（可见分光光度法）

产品组成：

产品说明：
硫化氢（H2S）是一种新型气态信号分子，存在于脑内的神经递质，生理浓度的 H2S 对神经系统海马的长时程增强功能具有重要的调节作用，并对自发性高血压、出血性休克及肝硬化等疾病的过程发挥着重要的病理生理效应。其在植物中也具有促进种子萌发、调节植物气孔、增强光合作用等作用，同时还会影响植物体内的氧化还原平衡和物质代谢。
H2S 与N, N-二甲基对苯二胺和硫酸铁铵等反应生成亚甲基蓝，亚甲基蓝在 665nm 处有最大吸收峰，通过测定其吸光值可计算H2S 含量。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 细菌或培养细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃培养液上清，按照细菌或细胞数量（104 个）： 提取液一体积（mL）=500-1000:1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min），12000g 4℃离心 10min；然后取 0.8mL 上清液， 再加入 0.15mL 提取液二，漩涡震荡 30s，12000g 4℃离心 10min，取上清置于冰上待测。
2. 组织样本：按照组织质量（g）：提取液一体积（mL）为 1:5-10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液一），进行冰浴匀浆；12000g 4℃离心 10min；然后取 0.8mL 上清液，再加入 0.15mL 提取液二，漩涡震荡 30s，12000g 4℃离心 10min，取上清置于冰上待测。
3. 血清（浆）或其它液体样本：取 100μL 血清（浆）或其它液体加入 1mL 提取液一，12000g 4℃离心 10min； 然后取 0.8mL 上清液，再加入 0.15mL 提取液二，漩涡震荡 30s，12000g 4℃离心 10min，取上清置于冰上待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 665nm，蒸馏水调零。

2、加样表（按顺序在EP 管中加入下列试剂）

充分混匀，室温静置 10min 后，665nm 处测定各管吸光值A，分别记为 A 测定、A 空白，计算 ΔA=A 测定-A 空白。（空白管只需做 1~2 管）
三、H2S 含量计算
标准曲线回归方程 y = 0.0026x-0.0268（其中 ΔA 为纵坐标 y，标准溶液浓为横坐标 x），将 ΔA 带入公式中得到 x（nmol/mL）。
1、按照样本质量计算
H2S 含量（nmol/g 质量）= x×（V 上清+V 提取液二）÷（W×V 上清÷V 提取液一）=1.1875×x÷W 2、按照细胞数量计算
H2S 含量（nmol/104 cell）= x×（V 上清+V 提取液二）÷（细胞数量×V 上清÷V 提取液一）
= 1.1875×x ÷细胞数量
3、按照液体体积计算
H2S 含量（nmol/mL）= x×（V 上清+V 提取液二）÷[V 液体×V 上清÷（V 提取液一+V 液体）]= 13.0625×x
V 上清：提取时上清液的体积：0.8mL；V 提取液一：加入提取液一的体积：1mL；V 提取液二：加入提取液二的体积：0.15mL；V 样本：反应液中加入样本的体积，0.25mL；V 液体：提取时液体体积，0.1mL；W：样本质量，g；细胞数量：以万计。
注意事项：
1、如果 ΔA 值过低或接近空白值，建议增加样本量（增大样本质量提取）后再进行测定；如果ΔA＞0.6，建议稀释样本后再进行测定，计算公式中要乘以相应的稀释倍数。