脯氨酸脱氢酶（ProDH）活性检测试剂盒说明书（可见分光光度法）
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液一 | 液体 60 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
提取液二 | 液体 0.6 mL×1 支 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 40 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂二：临用前加入 5 mL 蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂 4℃保存；、
2、试剂三：临用前加入 4 mL 蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂 4℃保存；
3、试剂四：临用前加入 10 mL 蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂可分装-20℃保存，避免反复冻融。
4、工作液的配制：首先将试剂三和试剂四配成溶液，临用前根据用量按照试剂一（V）：试剂二（V）：试剂三（V）=1.6（mL）：0.2（mL）：0.15（mL）的比例充分混匀。（注意：现配现用，用多少配多少）
产品说明：
ProDH是存在于线粒体内的催化脯氨酸降解的关键酶。降低ProDH活性对于调节渗透平衡、防止渗透胁迫对植物造成伤害、清除自由基、保护细胞结构具有重要意义。
ProDH催化脯氨酸脱氢生成延丙酮酸，脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸（PMS）传递还原2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），并且在600nm处具有特征吸收峰，通过600nm吸光度的下降，测定2,6-DCPIP的还原速度，代表ProDH 活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
天平、低温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、丙酮、匀浆器/研钵、冰、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照组织质量（g）：提取液一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液一），进行冰浴匀浆，1500g 4℃离心 15min，取上清液于一支新的 EP 管中，加入 10μL 提取液二，涡旋混匀，冰浴放置 30min 后，15000g 4℃离心 20min，取上清置冰上待测。
2、细胞或细菌：按照细胞数量（104 个）：提取液一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液一），冰浴匀浆，1500g 4℃离心 15min，取上清液于一支新的 EP 管中，加入 10μL 提取液二，涡旋混匀，冰浴放置 30min 后，15000g 4℃离心 20min，取上清置冰上待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min以上，波长调至600nm，蒸馏水调零。
2、工作液置于 37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴 5min。
3、加样表（在1mL玻璃比色皿中分别加入下列试剂）
试剂名称（μL） | 测定管 | 空白管 |
工作液 | 800 | 800 |
试剂四 | 100 | 100 |
样本 | 100 | - |
蒸馏水 | - | 100 |
在1mL玻璃比色皿中分别加入上述试剂，充分混匀后于600nm处测定10s时的吸光值，迅速置于37℃ （哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴3min，拿出迅速擦干测定190s时的吸光值，空白管10s和190s的吸光度分别记为A1、A2，测定管10s和190s的吸光度记为A3、A4。计算ΔA测定=A3-A4，ΔA空白=A1-A2，ΔA=ΔA测定-ΔA空白（空白管只需做1-2次）。 |
三、ProDH酶活计算
1、按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每分钟每mg组织蛋白在每mL反应体系中使600nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。
ProDH（U/mg prot）=ΔA÷0.01×V反总÷（V样×Cpr）÷T =333.33×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算：
单位定义：每分钟每g组织在每mL反应体系中使600nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。
ProDH（U/g 质量）=ΔA÷0.01×V 反总÷(W× V样÷V样总)÷T =333.33×ΔA÷W
3、按细胞数量计算：
单位定义：每分钟每1万个细胞在每mL反应体系中使600nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。
ProDH（U/104 cell）=ΔA÷0.01×V 反总÷(500× V样÷V样总)÷T =0.67×ΔA
V反总：反应体系总体积，1mL；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，3min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：500万个细胞。
注意事项：
1、ΔA大于0.6时或者A3大于1.5时建议将样本上清用蒸馏水稀释后再进行测定。
2、控制A3在0.8以上，若A3小于0.8，建议将样本上清用蒸馏水稀释后再进行测定。
3、空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.02。
