γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）活性检测试剂盒说明书（可见分光光度法）

产品组成：

溶液的配制：
1、试剂二：临用前加 14 mL 蒸馏水充分震荡溶解，用不完的试剂-20℃分装保存，禁止反复冻融；
2、试剂三：临用前加 5 mL 蒸馏水充分震荡溶解；
3、试剂五：临用前加入 30 mL 蒸馏水，充分震荡溶解后，缓缓加入 1.0 mL 浓硫酸（自备），边加边搅拌；
4、标准品：1 μmol/mL 磷标准溶液。临用前将标准液用蒸馏水稀释成 0.1 μmol/mL 磷标准溶液。
产品说明：
GCL（glutamate cysteine ligase）是GSH合成的限速酶，GSH对GCL有反馈抑制作用。GCL基因表达受多种因素调节，如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL活性高低对GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影响。
在ATP和Mg2+存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同时ATP去磷酸化产生无机磷分子，通过测定无机磷增加速率，即可计算出GCL活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、冷冻离心机、水浴锅、移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、浓硫酸和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一） 进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2. 细菌、细胞：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体：直接测定。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min，调节波长到660nm，蒸馏水调零。
2、 加样表：

三、GCL活性计算
1、 按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃下，每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol无机磷的GCL酶活量为1个酶活力单位。
GCL（U/mg prot）=[ΔA测÷（ΔA标÷C标准液）×V反总]÷(Cpr×V样)÷T=0.0544×ΔA测÷ΔA标÷Cpr 2、 按样本质量计算
活性单位定义：37℃下，每克样本每分钟催化产生1μmol无机磷的GCL酶活量为1个酶活力单位。
GCL（U/g 质量）=[ΔA测÷（ΔA标÷C标准液）×V反总]÷(W÷V样总×V样)÷T=0.0544×ΔA测÷ΔA标÷W 3、 按细胞数量计算
活性单位定义：37℃下，每104个细胞每分钟催化产生1μmol无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL（U/104 cell）=[ΔA测÷（ΔA标÷C标准液）×V反总]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
=0.0544×ΔA测÷ΔA标÷细胞数量
4、 按照液体体积计算
活性单位定义：37℃下，每mL液体每分钟催化产生1μmol无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL（U/mL）=[ΔA测÷（ΔA标÷C标准液）×V反总]÷V样÷T=0.0544×ΔA测÷ΔA标
V反总：反应总体积，0.98mL；V样：加入样本体积，0.12mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；T：反应时间，15min；C标准液：磷标准溶液浓度，0.1μmol/mL；V 样总：加入试剂一的体积，1mL；W：样本质量，g； 细胞数量：以104为单位计算，万个。

注意事项：
1、样本处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，以免影响其活力。如果是匀浆液，避免反复冻融。
2、样本测定前先取 1-2 个样做预实验，如吸光值大于 1，应先用试剂一(或者生理盐水)稀释到适当倍数，哺乳动物组织和血液一般稀释 3-5 倍。
3、细胞中 GCL 活性测定时，细胞数目须在 300 万-500 万之间，细胞中 GCL 的提取时可加试剂一（或生理盐水） 后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。
4、试剂三配制完成后，请一周内使用完。
5、试剂五配制过程中，可能会产生黑色固体，其不影响结果，注意吸取时不要将黑色固体吸入。该溶液配制完成后应为浅黄色，若为蓝色则已污染，不可再使用。
6、测定吸光值时请于水浴后 10-40 分钟内测完。