人谷氨酸-半胱氨酸连接酶（GLCL）Elisa 试剂盒
使用说明
用途
本试剂盒仅供科研使用，定量检测细胞液、体液、组织、血清、血浆等标本中人谷氨酸-半胱氨酸连接酶（GLCL）的含量。
原理:
采用双抗体夹心法测定人谷氨酸-半胱氨酸连接酶（GLCL）水平。用纯化的人谷氨酸-半胱氨酸连接酶（GLCL）抗体包被微孔板，制成固相载体，实验时依次在微孔板中加入样本及标准品，并加入 HRP 标记的谷氨酸-半胱氨酸连接酶（GLCL）抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，反复洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化为蓝色，再用硫酸终止反应，转变成黄色。颜色的深浅和样品中的谷氨酸-半胱氨酸连接酶（GLCL）含量呈正相关。采用酶标仪在 450nm 波长测定吸光度（OD 值），根据标准曲线，计算测试样品中谷氨酸-半胱氨酸连接酶（GLCL）活性。
试剂盒组成
序号 | 名称 | 规格 |
| | |
1 | 酶标包被板 | 96 孔*1 可拆卸板 |
2 | 酶标试剂 | 6ml*1 瓶 |
3 | 标准品(浓度 800U/L) | 0.6ml*1 瓶 |
4 | 标准品稀释液 | 2ml*1 瓶 |
5 | 生物素标记的抗 T抗体 | 1.5ml*1 瓶 |
6 | 显色剂 A液 | 6ml*1 瓶 |
7 | 显色剂 B液 | 6ml*1 瓶 |
8 | 终止液 | 6ml*1 瓶 |
9 | 浓缩洗涤液（*30） | 20ml*1 瓶 |
10 | 封板膜 | 1 张 |
11 | 使用说明书 | 1 份 |
实验材料与试剂配制：
1、仪器与材料：酶标仪（使用前预热30分钟），微量加液器、吸头、蒸馏水或去离子水，滤纸。
2、洗液的配制：按1:30的比例配制洗液备用。
样品收集、处理及保存
1、细胞培养上清：适用于检测体外培养的细胞分泌性成份。用无菌管收集细胞上清液，以1000×g离心15分钟，收集上清。
2、细胞：用PBS反复洗涤细胞3次，调整细胞浓度达到104-106/ml 左右，通过反复冻融，使细胞破坏并放出细胞内成份，或者细胞超声粉碎，离心取上清液检测。
3、血清：在室温下，血液自然凝固，以1000×g离心15分钟，取上清待测。
4、血浆：应根据标本的要求选择EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合后静置10-20 分钟后，以1000×g离心15分钟，收集上清。
5、体液：包括胸腹水、脑脊液，分泌物等。使用不含热原和内毒素的离心管收集，以1000×g离心15分钟，收集上清。
6、组织标本：切取组织标本，称取重量0.5mg，加入500ul 的PBS，用手工或匀浆器，或超声破碎仪将标本匀浆，以2000-3000 rmp离心20 分钟，收集上清进行检测。
7、样品中不能含有NaN3，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
8、保存：如果样品不能立即检测，应将其分装，-70 ℃保存，避免反复冷冻。保存过程中如出现沉淀，应再次离心。血液标本尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中含大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
操作步骤：
1、取出试剂盒，室温（20-25℃）放置 30 分钟。
2、分组：取出 96 孔板，根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，把剩余的板条继续冷藏处理。分别设标准品组（6 个浓度）、空白孔、待测样品组。
标准品的稀释：准备小试管6 只，依次编好号码，先在各小试管中加入标准品稀释液100ul，然后取原浓度标准品100ul 加入一只已编好号的试管中，充分混匀;再在该试管中取100ul 加入第二支试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul 加入第三只试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul 加入第四只试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul 加入第五只试管中，充分混匀；然后在该试管中取100ul，弃掉。第六只试管作为0 号标准品。稀释后各管浓度分别是：
400 U/L,200 U/L,100 U/L,50 U/L,25 U/L ,12.5 U/L。
注：为减少实验误差，保证准确性，建议设置复孔。
3.加样：依照标准品的顺序分别加入 50ul 的标准品溶液于空白微孔中；空白对照孔加入 50ul 的蒸馏水；其余微孔中先加样40ul 然后再加生物素标记的抗 T 抗体 10ul。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
4.温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。
6.加酶标溶液：标准品组、待测样本组各孔中加入 50ul 的酶标溶液（空白对照孔除外）。
7.温育：酶标板用封板纸密封后，放入湿盒内于 37℃恒温孵育 1 小时。
8.洗板：用稀释后的洗涤液注满每孔，静置 15-30s，充分清洗酶标板 5 次，用吸水纸彻底拍干。
9.显色：各孔加入显色剂 A 液 50ul 后，再加入显色剂 B 液 50ul。
10.终止：25-37℃下避光反应 10-15 分钟，加入 50ul 终止液。
11.读板：在 450nm 波长读取各孔的 OD 值。
注：读板时必须拭干板底残留的液体和手指痕迹，读板时间控制在终止反应后的 30 分钟内，以免影响准确性。
数据计算
1、绘制标准曲线：各标准品 OD 值减去底色即减去空白孔 OD 值，以 6 个标准品的 OD 值为纵坐标 y，以标准品的浓度为横坐标 x，绘制曲线图，如图示，并计算出回归方程 y=ax+b。
2、将待测样品的 OD 值代入方程式，计算各组样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际 T 浓度。
3、敏感度：1.0 U/L
注意事项：
1、实验操作中必须使用一次性吸头，避免交叉污染。
2、加样：加样时，要控制加样速度，避免第一孔与最后一孔间的时间间隔过大，否则将会导致不同的预孵育时间，从而影响实验的准确性以及重复性。
3、孵育：严格按照说明书上规定的孵育时间和温度进行。
4、反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化，如果颜色较深，请提前加入终止液终止反应。
5、建议实验前预测样品含量，如样品浓度过高，应对样品进行稀释，计算结果时乘以相应的稀释倍数。
6、建议使用本试剂盒时先做预实验（即先做标准曲线，试用几个标本），如果对本试剂盒有任何疑问，可和所购经销商联系，如果因运输过程导致试剂盒失效，可要求调换，但概不承担产品本身以外的任何损失。
安全性
1、避免人体直接接触显色剂A、B和终止液。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
2、 实验中不要进食、抽烟或使用化妆品。
3、不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
保存条件及有效期：
1、试剂盒保存：2-8℃
2、有效期：6个月
