氯霉素乙酰转移酶检测试剂盒
(CAT Assay Kit)
产品说明：
氯霉素乙酰转移酶报告基因(chloramphenicol acetyltransferase, CAT)能将乙酰基从乙酰辅酶A转移到氯霉素上。该反应通常通过测量放射性标记的底物而量化，方法繁杂，耗费时间，且成本较高。本试剂盒采用荧光测定的方法，检测CAT活性，它的灵敏度接近同位素测定方法，而操作极为简便、快捷，成本也大为降低。使用通用裂解缓冲液，能与其他类型的报告基因检测和蛋白含量检测兼容。
产品内容与储存方法：
名称 | 数量 | 保存条件 |
| | |
5x Universal Lysis Buffer (通用裂解液) | 25 ml | -20℃ |
5x CAT Assay Buffer (CAT反应缓冲液) | 1 ml | -20℃ |
Chloramphenicol (氯霉素) | 0.5 ml | -20℃ |
AcCoA (乙酰辅酶A) | 0.5 ml | -20℃ |
Fluo Assay Buffer (荧光反应缓冲液) | 10 ml | -20℃ |
Fluo Reagent A (荧光试剂A) | 0.2 ml | -20℃ |
Fluo Reagent B (荧光试剂B) | 0.2 ml | -20℃ |
可作100次CAT检测。低温运输，-20℃或-80℃避光保存。有效期6个月。
所需其它试剂：
使用者需准备PBS 、双蒸水等。
操作方法：
裂解细胞：
- 新鲜配制裂解液：临用前，取适量5xUniversal Lysis Buffer (ULB)，用双蒸水稀释至1xULB，混匀。1xULB可在4℃存放数周。
- 细胞清洗：倾去培养板/皿中的培养液，加入足量PBS，轻轻洗涤细胞。完全倾去洗涤液。
- 细胞裂解：推荐按照表中的体积，在孔/皿中加入1xULB，混匀。培养板可在微型振荡器上震荡5~10 min；培养皿可直接用细胞刮刀刮下细胞，将细胞悬液移入1.5 ml 离心管，在涡旋振荡器上充分混悬震荡30秒。裂解细胞悬液离心1 min，取上清作荧光测定。
CAT反应：
反应前，在室温待CAT Assay Buffer和反应底物Chloramphenicol及AcCoA溶液溶化，置冰上。每10个反应，按次序混合250 μl 双蒸水、100 μl 5x CAT Assay Buffer、50 μl Chloramphenicol、50 μl AcCoA，混匀后在96孔板或微量离心管中分10份(45 μl)。每孔/
管中加入5 μl细胞裂解上清，于37℃孵育30 min至3小时（标准反应时间为1小时）。应设置同等细胞数的非转染细胞裂解上清作对照。
荧光测定：
测定前，在室温待Fluo Assay Buffer和Fluo Reagent B溶液溶化。每10个测定，按次序混合1 ml Fluo Assay Buffer、20 μl Fluo Reagent A、20 μl Fluo Reagent B，混匀配成荧光测
定液。将CAT反应混合液50 μl转入荧光测定板的样品孔中，每孔加入100 μl荧光测定液，室温放置1~2 min。在96孔板荧光测定仪上，采用340 nm激发波长、450 nm发射波长，测定荧光强度。非转染细胞的荧光值为荧光本底。
注意事项：
- AcCoA 溶液避免反复冻融，可分成小份冻存。Fluo Reagent A溶液应盖严存放，避免蒸发。
- 细胞裂解液可于-20℃长期保存。
- 细胞裂解液用量过多，会增加荧光本底。如细胞数量较多时，可用PBS稀释细胞裂解液至较低浓度后，进行CAT反应。由于CAT催化反应的线性范围通常较窄，适当减少细胞裂解液用量，还有助于增加实验的精确度。
- CAT活性较低时，可适当延长CAT反应的时间。但反应时间过长，也会增加荧光本底。
- 本试剂产生的荧光可稳定1小时以上。
- 如要准确定量测定CAT活性，需要通过同时测定CAT酶标准品的系列荧光值，绘制标准曲线，以计算样品的酶活性。
表：不同容器细胞所需1xULB的体积。
96孔板 | 48孔板 | 24孔板 | 12孔板 | 6孔板 | 35 mm平皿 | 60 mm平皿 |
| | | | | | |
80μl | 120μl | 180μl | 300μl | 600μl | 600μl | 1000μl |
|
