超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒说明书
注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。
规格：100T/96S
产品内容：
试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃避光保存；
试剂二：粉剂 ×1 支，4℃避光保存；临用前使用20ml试剂一充分溶解，配好的试剂4℃避光可保存一周。
试剂三：液体 110μL×1 支，4℃保存；临用前将试剂三用蒸馏水稀释10倍，用多少配多少。
试剂四：液体 2.5mL×1 瓶，-20℃保存。
试验中所需的仪器和试剂：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水
产品说明：
SOD（EC1.15.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生成 H2O2和 O2。SOD 不仅是超氧化物阴离子清除酶，也是 H2O2主要生成酶，在生物抗氧化系统中具有重要作用。
通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O2-.)，O2-.可与WST-8 反应产生水溶性染料甲臜，后者在 450nm 处有吸收；SOD 可清除 O2-.，从而抑制了甲臜的形成；反应液黄色越深，说明 SOD 活性愈低，反之活性越高。
操作步骤：
一、样品的前处理：
- 细菌、细胞或组织样品的制备：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液（生理盐水或者PBS），超声波破碎（功率 20%或 200w，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）。8000g 4℃离心 10 分钟，取上清， 置冰上待测。
称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液（生理盐水或者PBS）进行冰浴匀浆； 8000g 4℃离心 10 分钟，取上清，置冰上待测。
- 血清(浆)样品：直接检测
二、测定操作表：
- 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 450nm，蒸馏水调零。
- 测定前将试剂一、二和四 37℃水浴 5min 以上。
- 样本测定（按顺序加入下列试剂）
试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 1 | 对照管 2 | 对照管 3 |
样本 | 10 | | | |
蒸馏水 | | 10 | 10 | 10 |
试剂三（稀释后） | 10 | 10 | 10 | 10 |
试剂四 | 20 | 20 | 20 | 20 |
试剂二 | 160 | 160 | 160 | 160 |
充分混匀，室温静置 30min 后，450nm 处测定各管吸光值 A。
注意事项：
1、试剂三为酶，不可冷冻，使用时在冰上放置。
2、对照管只需要做三管，求平均值。
3、SOD 为什么有的样本测定管大于对照管，对照管数值在什么范围？对照管的范围是 0.4-1。对照管吸光值过低可能是：
- 试剂三活性低，可以适当减少稀释倍数；
- 没有按顺序加试剂；
- 反应时间不够，可以延长反应时间（反应时间可以延长到 40min）。
- 对照管吸光值过高可能是试剂三未按操作说明书稀释相应倍数。
- 可能是样本中杂质的影响太大，为了降低杂质的影响一般，将样本提取上清液用蒸馏水或提取液稀释 10 倍后再测，通常可以使测定正常。计算公式中乘以相应稀释倍数。
SOD 活性计算：
1、抑制百分率的计算
抑制百分率＝(A 对照管－A 测定管) ÷A 对照管× 100%
尽量使样本的抑制百分率在10-90%范围内。如果计算出来的抑制百分率小于10%或大于90%，则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需将样本用提取液适当稀释；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度比较高的待测样本。
2、SOD 酶活性单位：在上述黄嘌呤氧化酶藕联反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD 酶活力定义为一个酶活力单位(U/mL)。
3、SOD 酶活性计算：
血清（浆）SOD 活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1 －抑制百分率)×V 反总]÷V 样
=20×抑制百分率÷(1 －抑制百分率)
组织、细菌或培养细胞 SOD 活力计算：
按样本蛋白浓度计算
SOD 活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1 －抑制百分率)×V 反总]÷(V 样×Cpr )
=20×抑制百分率÷(1 －抑制百分率)÷Cpr
需要另外测定，建议使用上海优选生物科技有限公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
按样本鲜重计算
SOD 活性(U/g 鲜重)=[抑制百分率÷(1 －抑制百分率)×V 反总]÷(W ×V 样÷V 样总)
=20×抑制百分率÷(1 －抑制百分率)÷W
c.按细菌或细胞个数计算
SOD 活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1 －抑制百分率) ×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)
=0.04×抑制百分率÷(1 －抑制百分率)
V 反总：反应体系总体积，0.2mL；
V 样：加入反应体系中样本体积，0.01mL；
V 样总：加入提取液体积，1 mL；
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL ；
W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
