乙醇脱氢酶（ADH）活性检测试剂盒说明书（微量法）

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：UPLC-MS-4341

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员

溶液的配制：

1、 提取液：临用前将粉剂一倒入提取液中，溶液为悬浊液，使用前需摇匀；

2、 试剂二：临用前取 1 支试剂二加入 1mL 蒸馏水，可以-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融。1 支即可做 100T， 为延长试剂盒使用时间，遂多给一支。

产品说明：

ADH是生物体内短链醇代谢的关键酶，催化乙醇与乙醛可逆转换，在很多生理过程中起着重要作用。哺乳动物ADH主要在肝脏生成，肝脏损伤导致ADH释放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否异常。

ADH催化NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+，NADH在340nm处有吸收峰，而NAD+没有；测定340nm 吸光度下降速率，来计算ADH活性。注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可调式移液器、研钵/匀浆器、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。

2、 细菌、细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；16000g，4℃离心 20min，取上清液置冰上待测。

3、血清等液体：直接测定。

二、测定步骤

三、ADH活性计算

1. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1. 按蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。ADH (U/mg prot) =[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T

=1.61×(ΔA测定管–ΔA空白管) ÷Cpr

1. 按样本质量计算

活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。ADH (U/g 质量) =[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106] ÷(W×V样÷V样总)÷T

=1.61×(ΔA测定管–ΔA空白管)÷W

1. 按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。

ADH (U /104 cell) = [(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

=1.61×(ΔA测定管–ΔA空白管) ÷细胞数量

1. 按液体体积计算

活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。

ADH (U/mL) = [(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷V样÷T=1.61×(ΔA测定管–ΔA空白管)

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4L； 106：单位换算系数，1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，1min；细胞数量：以万计。

1. 使用96孔板测定的计算公式如下

1. 按蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。ADH (U/mg prot) =[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T

=2.68×(ΔA测定管–ΔA空白管) ÷Cpr

1. 按样本质量计算

活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。ADH (U/g 质量) =[(ΔA测定管–ΔA空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(W×V样÷V样总)÷T

=2.68×(ΔA测定管–ΔA空白管)÷W

1. 按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。