线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性检测试剂盒说明书(可见分光光度法)
货号：UPLC-MS-4588
规格：25T/24S、50T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称/规格 | 25T | 50T | 保存条件 |
提取液 | 液体 40 mL×1 瓶 | 液体 80 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 21 mL×1 瓶 | 液体 21 mL×2 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 支 | 粉剂×2 支 | -20℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1 支 | 粉剂×2 支 | 4℃保存 |
溶液的配制：
工作液的配制：临用前取试剂一、试剂二、试剂三，将试剂二和试剂三依次转移到试剂一中
产品说明：
线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素C氧化酶，也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责催化还原型细胞色素C的氧化，并最终把电子传递给氧生成水。还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素C生成氧化型细胞色素C，因此550nm光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
- 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1.0 mL 提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。4 ℃ 600g 离心 10min。
- 将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000g 离心 15min。
- 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。
- 在沉淀中加入 400μL 提取液，超声波破碎（功率 20%，超声 5 秒，间隔 10 秒，重复 15 次），用于复合体Ⅳ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。
2、 将工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育15min；用不完的试剂4℃可保存一周；
3、 样本测定（在1mL玻璃比色皿中分别加入）
试剂名称 | 测定管 | 空白 |
样本（μL） | 40 | - |
蒸馏水（μL） | - | 40 |
工作液（μL） | 800 | 800 |
立即混匀，分别记录测定管和空白管 550nm 处初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，测定管的记为 A1 测定管，A2 测定管，空白管的记为 A1 空白管，A2 空白管。计算 ΔA1=A1 测定管-A2 测定管，ΔA2=A1 空白管-A2 空白管，ΔA=ΔA1-ΔA2。
三、复合体Ⅳ活力单位的计算
按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。复合体Ⅳ活力(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1099×ΔA÷Cpr
V反总：反应体系总体积，8.4×10-4L；ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×104L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.04 mL； T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，需自行测定；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
注意事项：
1、 为保证实验结果的准确性，需先取 1-2 个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于 1），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若 ΔA 大于 0.4，需将样本稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数），使 A1-A2 小于 0.2，可提高检测灵敏度；若 ΔA 偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。
2、 由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量（单独测量）。
3、 本试剂盒试剂足够完成 50 管反应。
4、 附:使用样本重量计算公式：（检测样本数为 50T/24S）
A、上清中复合体Ⅳ活力的计算：
单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。复合体Ⅳ活力(U/g 质量)=[ΔA上清×V反总÷（ε×d）×109]÷(W÷V提取×V样)÷T=1099×ΔA上清÷W
ΔA上清：上清测定值；V反总：反应体系总体积，8.4×10-4L；ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×104 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.04mL；V提取：加入提取液体积，1.0mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
B、沉淀中复合体Ⅳ活力的计算：
单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。复合体Ⅳ活力(U/g 质量)=[ΔA沉淀×V反总÷（ε×d）×109]÷(W÷V提取×V样)÷T=440×ΔA沉淀÷W
