线粒体呼吸链复合体Ⅲ活性检测试剂盒说明书(可见分光光度法)
货号：UPLC-MS-4585
规格：25T/12S、50T/24S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称/规格 | 25T | 50T | | 保存条件 |
提取液 | 液体 20 mL×1 瓶 | 液体 40 mL×1 瓶 | | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 20 mL×1 瓶 | 液体 20 mL×2 瓶 | | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 支 | 粉剂×2 支 | | -20℃保存 |
试剂三 | 液体 3 mL×1 支 | 液体 5.5 mL×1 瓶 | | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、 工作液的配制：临用前把试剂二转移到试剂一中混合溶解，用不完的试剂 4℃可保存一周；
产品说明：
线粒体复合体Ⅲ（EC 1.10.2.2）又称CoQ-细胞色素C还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责把还原型CoQ的氢传递给细胞色素C，生成还原型细胞色素C。
与氧化型细胞色素C不同，还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收，因此550nm 光吸收增加速率能够反映线粒体复合体Ⅲ酶活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者
增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1.0 mL 提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 4 ℃ 600 g 离心 10min。将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000 g 离心 15min。
3、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅲ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。
4、 在沉淀中加入 200μL 提取液，超声波破碎（功率 20%，超声 5 秒，间隔 10 秒，重复 15 次），用于复合体Ⅲ
酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。
2、 操作表：在1mL玻璃比色皿中分别加入
试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 |
工作液 | 800 | 800 |
试剂三 | 100 | - |
37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确孵育2min，之后分别加入 |
样本 | 100 | 100 |
蒸馏水 | - | 100 |
立即混匀，记录550nm处初始吸光值A1和 2min 的吸光值A2，分别记为A1测定、A2测定，A1 对照、A2对照。计算ΔA=（A2测定-A1测定）-（A2对照-A1对照）。 |
三、复合体Ⅲ活力单位的计算
按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。复合体Ⅲ活力(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T=261×ΔA÷Cpr
V反总：反应体系总体积，0.001L；ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×104L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V
样：加入样本体积，0.1mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
注意事项：
1、 尽量保持比色皿内反应液温度在 37℃或 25℃。可以在记录初始吸光度 A1 后迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴中准确反应 2 分钟，之后迅速取出比色皿并擦干，记录 2min 时的吸光度。
2、 当测定吸光值大于 1 时，建议将样本用提取液稀释后测定，计算公式中注意乘以稀释倍数。
3、 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
4、 由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量(单独测定)。
5、 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
6、 本试剂盒试剂足够完成 50 管反应。
7、 附:使用样本重量计算公式：（样本检测数为 50T/12S）
A、上清中复合体Ⅲ活力的计算：
按样本质量计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1 nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。复合体Ⅲ活力(U/g 质量)=[ΔA1×V反总÷（ε×d）×109]÷(W÷V提取×V样)÷T=262×ΔA1÷W
ΔA1：上清测定值；V反总：反应体系总体积，0.001L；ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×104L/mol/cm；d： 比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL； V提取：加入提取液体积，1.0mL；W：样本质量，g；T：反应时间，2min；109：单位换算系数，1mol=109
