基孔肯雅热病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法/全预混)说明书
【产品名称】基孔肯雅热病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法/全预混)
【英文名称】Detection Kit for chikungunya virus (PCR-Fluorescence Probing/Premix)
【预期用途】
本试剂盒适用于血清样品的基孔肯雅热病毒的特异性检测。检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排 除病例的依据。
【检测原理】
本试剂盒采用RT-PCR方法结合荧光探针的扩增检测技术，反应在同一管内连续进行。反应液中酶、引物、 探针、buffer等已预混合，无需单独配制反应液。操作简单，并有效防止了污染，能对样品中的基孔肯雅热病毒 RNA进行快速检测。
【试剂盒组成】
组分 | 规格 25T/盒 | 规格 50T/盒 |
基孔肯雅热病毒 PCR反应液 （蓝盖管） | 1管（375 μl） | 1管（750 μl） |
基孔肯雅热病毒 阳性对照 （红盖管） | 1管（50 μl） | 1管（100 μl） |
阴性对照 （绿盖管） | 1管（1000 μl） | 1管（1000 μl） |
使用说明书 | 1份 | 1份 |
注意：不同批号的组分不可以互换使用，试剂盒中组分（包括阳性对照）使用前需完全融化并充分混匀（建议采用轻弹或颠倒的 方式混匀，不建议使用涡旋振荡器混匀），应尽量避免反复冻融!
【储存条件及有效期】
本试剂盒于-20℃保存，有效期为12个月。请于有效期内使用。
【适用仪器】ABI系列，Roche系列，BIO-RAD（含MJ）系列等荧光定量PCR检测仪等。
【样本要求】
样本采集注意无菌操作，采集后应及时检测，也可-20℃保存待测，保存期为4个月；长期保存请置于-70℃。 临床样本在运输和贮存过程中要避免反复冻融，应冷冻运输，运输时要附有必要的信息，如样本编号、发病
日期和样本采集日期。
【检验方法】
1. 样本前处理
血清：取样本6,000 rpm离心1 min，取上清备用。
注：为保证样本及检测结果的稳定性，推荐使用HBSS（不含钙、镁离子）作为病毒保存液，不建议使用生 理盐水、PBS缓冲液等。
2. 样品RNA提取（样本处理区）
可按常规方法提取，也可采用商品化试剂盒提取病毒RNA。本试剂盒阴性对照参与提取，用于对环境进行 监控。阳性对照无需提取，直接使用。
3. 反应组分配制
反应管 组分 | 检测管 | 对照管 | 阳性对照 | 阴性对照 | 基孔肯雅热病毒 PCR反应液 | 15 μl | 15 μl | 15 μl | 基孔肯雅热病毒 阳性对照 | ― | 5 μl | ― | 阴性对照 | ― | ― | 5 μl | 样品RNA | 5 μl | ― | ― | 总体积 | 20 μl | 20 μl | 20 μl |
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根据不同的PCR仪选择反应管，反应总体积为20 μl，反应液在配液区分装，加样在样本处理区，每个测试反应体系配制如下表：
4. 扩增（检测区）
按下列参数设置反应条件：
反应参数 | 反转录 | 预变性 | 45个循环 |
变性 | 退火/延伸 |
温度 | 50℃ | 95℃ | 95℃ | 55℃ |
时间 | 15 min | 3 min | 5 sec | 35 sec |
荧光信号采集设定在退火/延伸时。对于多通道荧光PCR仪，选择荧光素FAM为信号采集通道，淬灭基团选
None，染料校正选None。
【检测结果的解释】
1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增 曲线的最高点为准。
2 质控标准
2.1 阴性对照无典型S型扩增曲线显示或无Ct值。
2.2 阳性对照的Ct值应<30.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
3 结果描述及判定
3.1 阴性：无Ct值或Ct值≥40，表示样本阴性或者被检测样本核酸浓度含量低于试剂盒检测限。
3.2 阳性：Ct值≤37.0，且出现明显的指数增长期，表示样本阳性。
3.3 可疑：检测样本37.0时，重复一次。如果Ct值仍小于40，且曲线有明显的指数增长期，可报告 样本阳性，否则报告样本阴性或者被检测样本核酸浓度含量低于试剂盒检测限。
3.4 确认：对阳性结果，可采用其他方法进行确认。
【检测方法的局限性】
1. 样本检测结果与样本采集、处理、运送及保存质量有关。
2. 样本处理过程中发生交叉污染，则可能出现假阳性结果。
3. 病毒在流行过程中的基因突变则可能导致假阴性结果。
4. 检测结果仅供临床参考，如需确诊病例请结合临床症状及其他检测手段。
【产品性能指标】本试剂盒的最低检测限为500 copies/ml。
【试剂盒使用注意事项】
1. 有关实验室管理规范请严格按照行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检验实验室的管理规范执行。
2. 本试剂盒仅用于体外检测，操作人员应经过专业培训并具有一定经验，使用前请仔细阅读本说明书全文。
3. 实验请严格分区操作：第一区：PCR前准备区或配液区，准备扩增所需试剂；第二区：样本处理区，待 测样本和对照品处理；第三区：检测区，PCR扩增检测。
4. 所用的枪头和离心管都要经DEPC水处理，以灭活RNA酶。75%乙醇也要用DEPC处理过的水配制。
5. 试剂盒内各试剂使用前，充分融化后请稍微离心。反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查 各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。
6. 若阳性对照未充分混匀，可能出现阳性对照结果异常/不起线的情况。
7. 各区物品均为专用，不得交叉使用，避免污染，实验后请立即清洁工作台。实验中用过的吸头请直接打 入盛有1%次氯酸钠的废物缸内，并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。扩增完毕取出反应管后，立即密封在专用 塑料袋内，丢弃于指定地点。工作台及各物品定期用1%次氯酸钠、75%酒精或紫外灯进行消毒。
