UDPG 焦磷酸化酶（UGP）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

产品组成：

溶液的配制：

试剂一：临用前取一瓶加 30mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃可保存 4 周，禁止反复冻融。
试剂二：临用前取一瓶加 2.5 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂 2-8℃保存 2 周。
试剂三：临用前加 1.4 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃可保存 2 周，禁止反复冻融。
试剂四：临用前每支加 1 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃可保存 2 周，禁止反复冻融。
工作液的配制：将试剂一：试剂二：试剂三：试剂四：试剂五：试剂六按体积比=600：100：20：40：100：250 混合，现用现配。
产品说明：

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphosphprylase，UGP，EC 2.7.7.9）在自然界广泛分布。在葡萄糖合成糖原前催化葡萄糖活化，将1-磷酸葡萄糖与UTP分子合成为UDP-葡萄糖（UDPG），UDPG是高等植物和动物中主要活化酶的形式，作为葡萄糖基供体参与糖原、蔗糖、纤维素等的合成代谢。

UGP可逆的催化生成1-磷酸葡萄糖，其在磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下将NADP转化为NADPH，UGP活性可以用340nm的吸光值的变化来反应。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备设备和仪器

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

血清等液体：直接检测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 操作表：

三、UGP 酶活计算
按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

UGP（U/mg prot）=[ΔA÷（ε×d）×V 反总×10 9]÷(V 样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

按照样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每分钟产生1nmol 的NADPH定义为一个酶活力单位。

UGP（U/g 质量）=[ΔA÷（ε×d）×V 反总×10 9]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321.54×ΔA÷W

按照细胞数量计算
酶活单位定义：每104个细胞每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

UGP（U/104 cell）=[ΔA÷（ε×d）×V 反总×10 9]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.643×ΔA

按照液体体积计算
酶活单位定义：每毫升液体每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

UGP（U/mL）=[ΔA÷（ε×d）×V 反总×10 9]÷V 样÷T=321.54×ΔA

V反总：反应体系总体积，1×10 -3L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10 3L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g ；500：细胞或细菌总数，500万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

注意事项：

1、空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.01。

2、ΔA大于0.6或者A2测定大于1.2时，建议将样本稀释后再进行测定。当ΔA小于0.01时，可以延长反应时间（5min或10min）来测定。