土壤脱氢酶（S-DHA）活性检测试剂盒说明书
微量法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 A | 粉剂×2 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 B | 粉剂×2 支 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体 15 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体 30 mL×1 瓶（自备） | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂一：临用前取一支试剂一 B 加入一瓶试剂一 A 中，加入 2.5 mL 蒸馏水溶解。现配现用。配制好后避光保存于 2-8℃，最好在一周内使用，若出现红色，则不能使用（2.5mL 可以加 25 次）。
2、试剂三：自备乙酸乙酯。提供一个 15mL 试剂瓶。
产品说明：
土壤脱氢酶（Soil dehydrogenase，S-DHA）的活性可以反映土壤体系内活性微生物量以及其对有机物的降解活性，可以作为土壤微生物的降解性能指标。
氢受体2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride，TTC）在细胞呼吸过程中接受氢以后， 被还原为三苯基甲臜（Triphenyl Formazone，TF），TF呈现红色，在波长485nm处有最大吸收峰，在485nm测定其吸光值，即得土壤脱氢酶活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板（非聚苯乙烯材质）、研钵、30-50目筛、天平、恒温培养箱/水浴锅、低温离心机、冰、蒸馏水、乙酸乙酯。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、土壤样本：准确称取过30-50目筛的新鲜土壤样本约0.05g（以保证TTC与土壤颗粒充分接触）。
2、污泥样本：污泥用蒸馏水洗涤，12000rpm，25℃，离心10 min，弃上清，反复3- 4次。
二、测定步骤
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至485nm，分光光度计用蒸馏水调零。
2、操作表（在EP管中依次加入下列试剂）:
试剂名称 | 对照管 | 测定管 |
样本（g） | 0.05 | 0.05 |
试剂一（mL） | - | 0.1 |
试剂二（mL） | 0.2 | 0.1 |
充分混匀，置于37℃水浴锅/恒温培养箱中，暗培养24h，取出后立即冰浴5min |
试剂三（mL） | 0.3 | 0.3 |
剧烈震荡10min，15000rpm，4℃，离心10min，取200μL上清，于微量玻璃比色皿/96孔板（非聚苯乙烯材质），测定对照管和测定管的OD值，分别记为A对照、A测定。计算ΔA=A测定-A对照。注：每个测定管需设 一个对照管。 |
三、土壤脱氢酶活力计算
A、用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下
酶活单位定义：在37℃时，每小时每克样本使每mL反应体系OD值每增加0.01为一个酶活单位。土壤脱氢酶活性（U/g 土样）=ΔA÷0.01÷T÷W×V反总=41.67×ΔA
B、用96孔板测定的计算公式如下
酶活单位定义：在37℃时，每小时每克样本使每mL反应体系OD值每增加0.005为一个酶活单位。土壤脱氢酶活性（U/g 土样）=ΔA÷0.005÷T÷W×V反总=83.33×ΔA
T：反应时间，24h；W：样本质量，0.05g；V 反总：反应总体积，0.5mL。
注意事项：
1、试剂三易挥发，有毒，为了您的健康，请穿实验服，戴口罩，戴乳胶手套操作。
2、如果测定出来的吸光值较大，减少样本用量再进行测定；若吸光值过小则延长培养时间。注意同步修改计算公式。
3、如果离心后待测的上清依然浑浊，可尝试加大离心转速或延长时间，例如15000rpm，4℃，离心20min。
