乙醇含量检测试剂盒说明书（可见分光光度法）
货号：UPLC-MS-5077规格：50T/48S
产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体 157 μL×1 支 | -20℃保存 |
试剂二 | 液体 30 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂三 A 液 | 液体 15 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂三 B 液 | 液体 15 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
标准品 | 液体 0.5 mL×1 支 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂一：临用前根据实验所需用量，按照试剂一：蒸馏水=2.5μL:47.5μL（1T 的量）的比例，充分混匀， 现用现配。
2、 试剂三：临用前根据实验所需用量，按照试剂三 A 液：试剂三 B 液=1:1 的比例，充分混匀，现用现配。
3、 标准品：临用前取 10μL 和 390μL 蒸馏水混合配制成 0.428 mol/L 的标准溶液备用，现用现配。
产品说明：
酒是含酒精(乙醇)饮料的统称,乙醇是酒的主要成分,是衡量酒质量的重要指标之一。乙醇可用于制造醋酸、饮料、香精、染料、燃料等，医疗上常用体积分数为 70%~75%的乙醇作消毒剂。乙醇在化学工业、医疗卫生、食品工业、农业生产等领域都有广泛的用途。乙醇在乙醇氧化酶的催化下氧化产生过氧化氢。过氧化物酶催化过氧化氢氧化 4-氨基安替比林偶联酚，生成有色化合物，在 505nm 有特征吸收峰。测定 505nm 吸收峰的变化可以反应乙醇含量
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、可调式移液器、研钵/匀浆器、1 mL 玻璃比色皿、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照组织质量（g）︰蒸馏水体积(mL)为 1︰5~10 的比例（建议称取约 0.1 g 组织，加入 1 mL 蒸馏
水）进行冰浴匀浆，然后 8000 g，4℃，离心 10 min，取上清置于冰上待测。2、液体：直接检测。若液体浑浊可离心后取上清检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热 30 min 以上，调节波长至 505 nm，蒸馏水调零。
2、 操作表：
试剂名称（μL） | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
试剂一 | 50 | 50 | 50 |
试剂二 | 450 | 450 | 450 |
试剂三 | 450 | 450 | 450 |
样品 | 50 | | |
标准品 | | 50 | |
蒸馏水 | | | 50 |
充分混合后，立即测定 505nm 下的吸光值 A1，然后 37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）水浴中反应60min,再测定反应60min 的吸光值 A2。ΔA 测定=A2 测定管-A1 测定管，ΔA 标准=A2 标准管-A1 标准管, ΔA 空白=A2空白-A1 空白管，（空白管、标准管只需做 1-2 管）。 若样本数量过多，可将试剂一、试剂二、试剂三按比例配制成工作液使用。 |
三、乙醇含量计算
- 按样本质量计算
乙醇含量（mmol /g 质量）=（ΔA 测定-ΔA 空白）×C 标准÷（ΔA 标准-ΔA 空白）×V 样÷(V 样÷V 样总×W)
×F
=（ΔA 测定-ΔA 空白）×0.428÷（ΔA 标准-ΔA 空白）÷W×F
- 按液体体积计算
乙醇含量（mmol /mL）=（ΔA 测定-ΔA 空白）×0.428÷（ΔA 标准-ΔA 空白）×F
C 标准：标准管浓度，0.428 mol/L=0.428 mmol/mL ；V 样总：上清液总体积，1mL；V 样：加入反应体系中上清液体积，10μL=0.01mL；W：样本质量，g； F：稀释倍数。
注意事项：
1、如果测定吸光值 A＞1.5 或 ΔA＞0.5，建议稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数；如果测定吸光值较低或接近空白 OD 值，建议增加样本的加入量或者延长反应时间（2 小时或者更长时间）后再进行测定。
2、若样本数量过多，可将试剂一、试剂二、试剂三按比例配制成工作液使用。
3、建议一次测定不要测定过多样本以免耽误过多的酶促反应时间。
