丙酮酸羧化酶（PC）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 110 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 30 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 液体 10 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂五 | 液体 5 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂六 | 液体 15 μL×1 支 | 4℃保存 |
试剂六稀释液 | 液体 10 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂三：临用前加入 5 mL 蒸馏水溶解；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；
2、试剂四：临用前加入 5 mL 蒸馏水溶解；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；
3、试剂六：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前按试剂六：试剂六稀释液=1.6:660（V:V）的比例稀释试剂六备用，现用现配；
4、工作液的配制：按照试剂二：试剂三：试剂四=2:1:1 的体积比例充分混匀，现用现配。
产品说明：
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中，但在植物体和大部分细菌中却不含此酶。是供给草酰乙酸的主要补充反应，是糖异生过程的第一个限速酶。
PC不可逆的催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+，在340nm下测定NADH氧化速率，即可反映PC活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、4℃1000g 离心 10min。将上清液移至另一离心管中，4℃11000g 离心 15min。
3、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 PC（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。
4、在沉淀中加入 1mL 提取液，超声波破碎（功率 20%，超声 5 秒，间隔 10 秒，重复 12 次），用于 PC 活性测定，并且用于蛋白含量测定。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、试剂一用前37℃孵育15min。
3、操作表：在1mL石英比色皿中分别加入下列试剂：
试剂名称（μL） | 空白管 | 测定管 |
试剂一 | 450 | 450 |
工作液 | 320 | 320 |
试剂五 | 80 | 80 |
试剂六 | 100 | 100 |
样本 | | 50 |
蒸馏水 | 50 | |
在 1mL 石英比色皿中分别加入上述试剂，充分混匀后于 340nm 处测定 10s 时的吸光值 A1，迅速置于 37℃（哺乳动物）水浴 2min，拿出迅速擦干测定 130s 时的吸光值 A2，计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2测定，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。（空白管只需做 1-2 次） |
三、PC活性计算
单位的定义：每毫克蛋白每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。
PC酶活（U/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×Cpr）÷T=1607×ΔA÷Cpr
ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，1×10-3L；V样： 反应体系中样本体积，0.05mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间：2min；109：单位换算系数， 1mol=109nmol。
注意事项：
1、为保证实验结果的准确性，需先取 1-2 个样做预实验，ΔA 大于 0.8 时，建议将粗酶液用提取液稀释后再进行测定。当 ΔA 小于 0.01 时，可以延长反应时间（5min 或 10min）来测定。
2、空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过 0.05。
3、样本的蛋白浓度需自行测定，由于提取液中含有较高的蛋白浓度（约 1mg/mL），所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。
4、推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
5、本试剂盒试剂足够完成 50 管反应。
6附:使用样本重量计算公式：（样本检测数为 50T/24S）
A、上清中 PC 活力的计算:
酶活定义：每克样本每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
PC 酶活（U/g 质量）=ΔA1÷（ε×d）×109×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T = 1607×ΔA1÷W
ΔA1：上清测定值；ε：NADH 摩尔消光系数，
