脂肪酶（LPS）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体 80 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 液体 10 mL×1 瓶 | 常温保存 |
试剂三 | 液体 20 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
标准品 | 液体 59.3 μL×1 支 | 4℃保存 |
溶液的配制：
标准品：临用前加入 1.435 mL 无水乙醇配成 125 μmol/mL 的油酸标准溶液，充分溶解。用前注意解冻溶解。
产品说明：
LPS又称甘油酯水解酶，催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油（或者甘油二酯和单酯）。LPS广泛的存在于各种生物中。血清中LPS的异常增高常见于胰腺炎和胰腺癌。
LPS催化油酯水解成脂肪酸，利用铜皂法测定脂肪酸生成速率，即可计算LPS活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
研钵/匀浆器、台式离心机、震荡混匀器、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、甲苯、无水乙醇、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织样本：称取约0.1g样本，加试剂一1.0 mL充分研磨，于4℃，15000rpm离心30min，取上清液待测。血清样本：直接检测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至710nm，甲苯调零。
2、试剂一和试剂二置于37℃水浴预热30min 以上。
3、标准溶液的稀释：将125 μmol/mL的油酸标准溶液用无水乙醇稀释为125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.9μmol/mL的标准溶液待测。
4、操作表：
加入试剂（mL） | 空白管 | 测定管 | 标准管 |
试剂一 | 0.375 | 0.375 | 0.375 |
试剂二 | 0.125 | 0.125 | 0.125 |
反复震荡混匀 |
蒸馏水 | 0.2 | | |
上清液/血清 | | 0.2 | |
标准溶液 | | | 0.2 |
迅速震荡混匀后置于 37℃水浴准确反应 10 min |
甲苯 | 1 | 1 | 1 |
反复震荡混匀后，室温 4000rpm 离心 10 min |
取出离心管，小心吸取上层溶液 0.9 mL，加入另一 2 mL 塑料离心管中，按下表操作： |
试剂三 | 0.225 | 0.225 | 0.225 |
反复震荡混匀；室温 4000rpm 离心 10min，小心吸取上层溶液 800μL，加入 1mL 玻璃比色皿，于 710nm 处测定吸光值。记为 A 空白管、A 测定管、A 标准管，计算 ΔA 测定=A 测定管-A 空白管，ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。
三、LPS活性计算
1、标准曲线的绘制：以油酸标准溶液浓度为横坐标，ΔA标准为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b。将ΔA测定带入方程，得到x（μmol/mL）。
2、酶活计算：
a.按蛋白浓度计算：
活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。
LPS (U/mg prot) =x×V样÷（Cpr×V样) ÷T= 0.1×x÷Cpr
b.按样本质量计算：
活性单位定义：37℃中每克组织每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。
LPS (U/g 质量) =x×V样÷（W×V样÷V提) ÷T= 0.1×x÷W
c.按血清计算：
活性单位定义：37℃中每毫升血清每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。
LPS (U/mL 血清) =x÷T= 0.1×x
V样：加入反应体系中上清液体积，0.2mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测定；T：催化反应时间，10min；W：样本质量，g；V提：提取液体积，1mL。
注意事项：
1、甲苯有毒，实验过程中需佩戴手套和口罩。
2、实验过程中须远离火源。
3、当吸光度大于1时，建议将样本稀释后测量。
