离子结合型果胶（ISP）含量检测试剂盒说明书
可见分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液一 | 液体 100 mL×1 瓶（自备） | 4℃保存 |
提取液二 | 液体 30 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
提取液三 | 液体 50 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 60 mL×1 瓶（自备） | 4℃保存 |
试剂二 | 液体 3 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 液体 5 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
标准品 | 粉剂×1 支 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、提取液一：80%乙醇，自备。即将 80 mL 无水乙醇和 20 mL 蒸馏水混合。
2、试剂一：浓硫酸 60 mL，自备。
3、标准品：10 mg 半乳糖醛酸。临用前加入 0.943 mL 提取液三，配成 50 μmol/mL 的标准液。
产品说明：
果胶（Pectin）是构成细胞初生壁和中胶层的主要成分，对细胞起着软化和黏合作用。果胶间以Ca2+桥及其他离子键、氢键、糖苷键、酯键和苯环偶联的方式交联，通过不同的抽提方法可以提取各种形式的果胶，如水溶性果胶（WSP）、离子结合型果胶（ISP）和共价结合型果胶（CSP）。
利用带有螯合剂的酸性提取液提取离子结合型果胶（ISP），其在酸性条件下水解生成半乳糖醛酸，后者在硫酸溶液中与咔唑进行缩合反应形成紫红色的化合物，生成物质在530nm处有最大吸收峰。
技术指标：
最低检出限：0.0212 μmol/mL
线性范围： 0.025-2.5 μmol/mL
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、丙酮、浓硫酸、无水乙醇和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液一，室温快速匀浆，95℃水浴 20min，冷却至室温，4000g 25℃离心 10min， 弃上清。沉淀加入 1.5mL 提取液一和丙酮交替各洗 2 遍（涡旋振荡 2min 左右，4000g 25℃离心 10min，弃上清即可），沉淀即为粗细胞壁，加入 1mL 提取液二（去除淀粉）浸泡 15 小时，4000g 25℃离心 10min，弃上清，加入 1mL 提取液三，充分匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清液待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至530nm，蒸馏水调零。
2、将50μmol/mL标准液用提取液三稀释为2、1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1μmol/mL的标准溶液备用。
3、操作表：
试剂名称 | 空白管 | 标准管 | 对照管 | 测定管 |
样本（μL） | - | - | 100 | 100 |
标准品（μL） | - | 100 | - | - |
蒸馏水（μL） | 100 | - | - | - |
试剂一（μL） | 800 | 800 | 800 | 800 |
混匀、90℃放置10min，取出后冷却 |
试剂二（μL） | - | - | 100 | - |
试剂三（μL） | 100 | 100 | - | 100 |
混匀，25℃静置 30min 后测定 530nm 处吸光值，分别记为 A 空白管、A 标准管、A 对照管和 A 测定管。ΔA 标准=A 标准管-A 空白管，ΔA 测定=A 测定管-A 对照管。 |
三、ISP含量的计算
1、标准曲线的绘制：
以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA测定带入方程得到x（μmol/mL）。
2、离子结合型果胶含量的计算：
离子结合型果胶含量(μmol/g 质量)=x×V提取液三÷W =x÷
