结合态淀粉合成酶（GBSS）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
产品组成：
试剂名称/规格 | 25T | 50T | 保存条件 |
提取液 | 液体 50 mL×1 瓶 | 液体 100 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 20 mL×1 瓶 | 液体 40 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 瓶 | 粉剂×2 瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1 瓶 | 粉剂×2 瓶 | -20℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1 瓶 | 粉剂×2 瓶 | -20℃保存 |
试剂五 | 粉剂×1 瓶 | 粉剂×2 瓶 | -20℃保存 |
试剂六 | 粉剂×2 支 | 粉剂×4 支 | -20℃保存 |
试剂七 | 液体 250 μL×2 支 | 液体 250 μL×3 支 | -20℃保存 |
试剂八 | 液体 12.5 μL×1 瓶 | 液体 12.5 μL×2 瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂四：临用前每支加入 5 mL 试剂一。
2、试剂五：临用前每支加入 8 mL 试剂一。
3、试剂六：临用前取 1 支加入 208 μL 双蒸水，充分溶解备用，用不完的试剂 4℃保存。
4、试剂八：每支临用前加入溶解好的 4 mL 试剂四。
5、反应液Ⅰ的配制：临用前在试剂二中加入 7 mL 试剂一，缓慢加热，逐渐升温使其溶解，冷却后加入试剂三混合溶解，这样可以分两批配制并且测定。
产品说明：
GBSS（EC 2.4.1.21）以束缚态存在于淀粉体中，催化淀粉链的加长反应，主要负责直链淀粉的合成。
GBSS催化ADPG与淀粉引物(葡聚糖)反应,将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生成ADP；进一步通过反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化NADP+还原为NADPH，其中NADPH生成量与前一步反应生成的ADP数量呈正比，通过340nm下测定NADPH的增加量，可以计算GBSS活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
称取约 0.1g 组织加入 1mL 提取液，冰浴中匀浆。10000g ，4℃离心 10min，弃上清，在沉淀中加入 1mL 提取液充分混匀，置冰上待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、在EP管中按顺序加入下列试剂
试剂名称（μL） | 测定管 |
样本 | 200 |
反应液Ⅰ | 270 |
混匀，30℃保温20min，置沸水浴中1min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却 |
试剂八 | 150 |
混匀，30℃保温30min，置沸水浴中1min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却，10000g 常温离心10min，取上清液。37℃预热试剂五和上清液。 |
上清液 | 450 |
试剂五 | 300 |
试剂六 | 15 |
试剂七 | 15 |
混匀后立即在 340nm 波长下记录初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。
注意：试剂二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混匀。
三、GBSS 活性计算
1、按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。GBSS活性（U/mg prot）=[ΔA÷（ε×d）×V测]÷(Cpr×V样÷V反总×V上清) ÷T =43.2×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
2、按照样本质量计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。GBSS活性（U/g 质量）=[ΔA÷（ε×d）×V测]÷(W÷V提取×V样÷V反总×V上清) ÷T=43.2×ΔA÷W
V测：测量体积，0.78mL；V反总：反应体积，0.62mL；V提取：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，20min；ε： NADPH消光系数，6.22×10-3mL/(nmol˙cm)；d：石英比色皿光径，1cm；V样：加入样本的量，0.2mL；V上清：吸取上清液的量，0.45mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
