磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 60 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 45 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 液体 45 μL×1 支 | 4℃保存 |
试剂四 | 液体 155 μL×1 支 | 4℃保存 |
试剂五 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂二：临用前加入 35 mL 试剂一溶解。可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融。
2、试剂三：液体置于试剂瓶内 EP 管内。临用前加入蒸馏水按体积比 1：120 稀释，现用现配。
3、试剂四：液体置于试剂瓶内 EP 管内。临用前加入蒸馏水按体积比 7：250 稀释，现用现配。
4、试剂五：粉剂置于试剂瓶内玻璃管内。临用前加入 2.5 mL 蒸馏水充分溶解；可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融。
5、工作液的配制：将试剂二、试剂三、试剂四按 7:1:1（V:V:V）的比例配制工作液，工作液现用现配。
产品说明：
PEPCK（EC 4.1.1.32）广泛存在于动物、开花植物、藻类、部分真菌和细菌中。该酶催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸，是调节糖异生途径的第一限速酶。
PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO2，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PEPCK活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液） 进行冰浴匀浆，然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清，置冰上待测。
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
血清（浆）样本：直接检测。
二、测定步骤
1、紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、将工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热5分钟。
3、操作表：在1mL石英比色皿中依次加入下列试剂：
试剂名称 | 空白管 | 测定管 |
样本（μL） | | 50 |
蒸馏水（μL） | 50 | |
工作液（μL） | 900 | 900 |
试剂五（μL） | 50 | 50 |
加入试剂五后立即混匀，于 340nm 处测定初始吸光值 A1 和 1min 时的吸光值 A2，计算 ΔA 测定管= A1 测定-A2 测定，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管（空白管只需做 1-2 次）。 |
三、PEPCK酶活计算
1、按蛋白浓度计算
酶活定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK酶活（U/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×Cpr）÷T= 3215.4×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算
酶活定义：每g组织每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK酶活（U/g 质量）= ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T=3215.4×ΔA÷W
3、按细菌或细胞数量计算
酶活定义：每104个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK酶活（U/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（500×V样÷V样总）÷T= 6.43×ΔA
4、按血清（浆）体积计算
酶活定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK（U/mL）＝ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷V样÷T=3215.4×ΔA
ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，0.001L；V 样：反应体系中样本体积，0.05mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g，T：反应时间：1min；500：细菌或细胞总数，500 万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
注意事项：
1、当 A1 小于 1 或 ΔA 大于 0.6 时，建议将样本稀释适当倍数后再进行测定，以提高检测灵敏度。
2、酶活性高的样本如动物肝、肾等组织，建议将样本用提取液稀释 5 倍或 5 倍以上测定。
3、空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过 0.06。
4、加样、混匀等步骤要迅速，秒表计时要准确，如果条件允许建议由两人配合完成本测定试验。
