NAD-苹果酸酶（NAD-ME）活性检测试剂盒说明书 紫外分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 70 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 40 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 粉剂×2 支 | 4℃保存 |
试剂四 | 粉剂×2 支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂二：临用前加入 20 mL 提取液充分溶解备用；
2、试剂三：临用前每支加 1 mL 双蒸水充分溶解备用；
3、试剂四：用时每支加 500 μL 双蒸水充分溶解备用；
4、工作液：在 15 mL 试剂二中加入 2 mL 试剂三和 1 mL 试剂四，可以根据比例现用现配。
产品说明：
ME广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和CO2，以及伴随NAD(P)+的还原反应，是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物ME活性测定较多，已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将ME分为NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。
NAD-ME催化NAD+还原成NADH，在340nm下测定NADH增加速率。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、细菌、细胞或组织样本的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20%，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样本：直接检测。
二、测定步骤
1、紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、将试剂一在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中保温15min左右。
3、操作表：
试剂名称（μL） | 测定管 |
试剂一 | 600 |
工作液 | 270 |
样本 | 30 |
将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中，混匀后在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种），340 nm 波长下记录初始吸光度 A1 和反应 5min 后的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。
三、NAD-ME 活性计算
1、组织中NAD-ME活力的计算：
- 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。NAD-ME（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T=965×ΔA÷Cpr
- 按样本质量计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。NAD-ME（U/g 质量）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×W) ÷T =965×ΔA÷W
2、细菌或细胞中NAD-ME活力的计算：
- 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。NAD-ME（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T=965×ΔA÷Cpr
- 按细菌或细胞数量计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。NAD-ME（U/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×500) ÷T=1.93×ΔA
3、血清中NAD-ME活力的计算：
单位的定义：每mL血清在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。NAD-ME（U/mL）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T =965×ΔA
V反总：反应体系总体积，9×10-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样： 加入样本体积，0.03mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W： 样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
注意事项：
1、若A2-A1大于0.5，需将样本用提取液稀释，使A2-A1小于0.5，可提高检测灵敏度。
2、实验时，样本在冰上放置，以免变性和失活。试剂一在37℃或25℃水浴放置。
3、 在比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放入此烧杯中。
4、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
5、注意：如果ΔA＜0.01，可将反应时间延长到10分钟。
