抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体 90 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×2 瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 液体 0.25mL×1 支 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂二：临用前加入 10 mL 蒸馏水充分溶解；4℃可以保存 1 周。（由于试剂稳定性较差，故多给一瓶）
2、试剂三：临用前根据样本量取适量试剂三用蒸馏水稀释 100 倍使用即可。
产品说明：
APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX 具有多种同功酶，分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体，以及过氧化体和类囊体膜上。APX催化 H2O2氧化 AsA， 是植物 AsA 的主要消耗者。APX 的活性直接影响到 AsA 的含量，在胁迫和解胁迫条件下，APX与 AsA 具有一定的负相关性。
APX 催化 H2O2氧化 AsA，通过测定 AsA 的氧化速率，可计算得 APX 活力。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、低温离心机、移液枪、研钵/匀浆器、水浴锅、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。13000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长到 290nm，用蒸馏水调零。
2、试剂一在 25℃中预热 30min 以上。
3、空白管：依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 蒸馏水、700μL 预热的试剂一、100μL 试剂二和 100μL 试剂三， 迅速混匀后在 290nm 测定 10s 和 130s 的吸光度 A1 和 A2，ΔA 空白管=A1-A2。
4、测定管：依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 上清液、700μL 预热的试剂一、100μL 试剂二和 100μL 试剂三， 迅速混匀后在 290nm 测定 10s 和 130s 的吸光度 A3 和 A4，ΔA 测定管=A3-A4。
三、APX 活力计算
（1） 按样本蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1μmol AsA 为 1 个酶活单位。APX(U/mg prot) = (ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d）×V 反总×106÷(Cpr×V 样)÷T=1.79×(ΔA 测定管-ΔA 空白管) ÷ Cpr
（2） 按样本质量计算
单位的定义：每 g 组织每分钟氧化 1μmol AsA 为 1 个酶活单位。
APX(U/g 质量)= (ΔA 测定管-ΔA 空白管)÷(ε×d）×V 反总×106÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=1.79×(ΔA 测定管-ΔA 空白管) ÷W
ε：AsA 在 290nm 处摩尔吸光系数，2.8×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积， 1000μL=1×10-3L；106：单位换算系数，1mol=1×106μmol；V 样：加入反应体系中上清液体积，100μL=0.1mL；Cpr： 上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V 样总：加入试剂一体积，1mL；W：样本质量，g；T：催化反应时间，2min。
