单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 60 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 30mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂四 | 液体×1 瓶 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂二：临用前加入 5 mL 蒸馏水充分溶解，4℃保存；
2、试剂三：临用前加入 5 mL 蒸馏水充分溶解，可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融；
3、试剂四：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前加 5 mL 试剂一充分溶解，可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融。
产品说明：
MDHAR催化MDHA还原生成AsA，在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。
MDHAR催化NADH还原MDHA生成AsA和NAD+，NADH在340nm有特征吸收峰，但是NAD+没有。通过测定340 nm光吸收下降速率，来计算出MDHAR活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
研钵/匀浆器、冰、台式离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、可调式移液枪和双蒸水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）1：5-10的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液） 进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
2、细菌、细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500-1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声破碎细胞（功率 300w，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min）；然后 10000rpm，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零。
2、试剂一在25℃水浴锅中预热30min。
3、依次在石英比色皿中加入下列试剂
试剂名称（μL） | 空白管 | 测定管 |
试剂二 | 100 | 100 |
试剂三 | 100 | 100 |
试剂四 | 100 | 100 |
试剂一 | 400 | 400 |
蒸馏水 | 300 | |
上清液 | | 300 |
迅速混匀后于 340nm 比色，记录 30s 和 150s 的吸光值。分别记为 A1、A2，ΔA=A1-A2，得到 ΔA 测定管、ΔA 空白管。三、MDHAR 活性计算
1、按蛋白浓度计算
MDHAR活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为一个酶活单位。MDHAR (U/mg prot) =[(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T
=0.268×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷Cpr
2、按样本质量计算
MDHAR活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1μmol NADH为一个酶活单位。MDHAR (U/g 质量) =[(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V样÷V样总×W)÷T
=0.268×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷W
3、按细胞数量计算
MDHAR活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmol NADH为一个酶活单位。MDHAR (U/104 cell) =[ (ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
=0.268×(ΔA测定管-ΔA空白管) ÷细胞数量
ε：NADH摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；106：单位换算系数，1mol=1×106μmol；V 反总：反应体系总体积，1mL=0.001L；V样：加入反应体系中上清液体积，300μL=0.3mL；V样总：提取液体积，1mL； Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定；W：样本质量，g；细胞数量：以104为单位计量，万个；T：反应时间，2min。
注意事项：
1、当 ΔA 测定大于 0.3 时，建议客户稀释样本或者调整试剂一和上清液的比例（如将 400μL 试剂一+300μL 上清液改为 600μL 试剂一+100μL 上清液）后进行测定。
2、当 ΔA 测定过小时，建议客户提高样本量或者调整试剂一和上清液的比例（如将 400μL 试剂一+300μL 上清液改为 200μL 试剂一+500μL 上清液）。
3、当 A1 大于 1.5 时，建议将样本稀释进行测定。
4、空白管为检测各管试剂组份的检测孔，正常情况下，其 OD 值在 0.5 左右，变化不超过 0.01。<
