脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
产品内容：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 60 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 30 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂四 | 液体 10 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
标准品 | 粉剂×1 支 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂二：临用前加入 3 mL 蒸馏水充分溶解，用不完的试剂-20℃分装保存 2 周。
2、试剂三：粉剂置于试剂瓶内 EP 管中。临用前加入 3.5 mL 蒸馏水充分溶解，4℃保存。
3、标准品：临用前加入 1 mL 蒸馏水，配制成 10mg/mL 的标准溶液。
产品说明：
脱氢抗坏血酸还原酶（Dehydroascorbate reductase，DHAR）是植物体内一种重要的抗氧化酶，是抗坏血酸- 谷胱甘肽氧化循环中促进抗坏血酸再生的关键酶。DHAR 在循环中利用抗坏血酸维持植物体内抗坏血酸的正常代谢水平，保护细胞组分抵御氧化损伤方面发挥着重要作用。
DHAR 催化还原型谷胱甘肽（GSH）还原脱氢抗坏血酸（DHA）生成 AsA，GSH 能和 5,5’-二硫代-双-（2- 硝基苯甲酸）（DTNB）反应产生 2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。TNB 在波长 412nm处具有最大光吸收。通过测定 GSH 的减少速率，计算 DHAR 活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
研钵/匀浆器、冰、低温离心机、可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿、水浴锅、可调式移液器和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照组织质量（g）:提取液体积（mL）1：5-10 的比例（建议称取约 0.1 g 组织，加提取液 1 mL），冰上充分研磨匀浆，8000g，4℃，离心 10 min，取上清液置于冰上待测。
2、细菌、细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500-1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1 mL 提取液），冰浴超声破碎细胞（功率 300w，超声 3s，间隔 7s，总时间 3 min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
3、血清等液体：直接检测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30min，调节波长到 412nm，蒸馏水调零。
2、标准溶液的配制：将 10mg/mL 标准液用蒸馏水稀释为 0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 mg/mL
的标准溶液备用。
3、加样表
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 空白管 | 空白对照管 | 标准管 | 标准空白管 |
样本 | 50 | 50 | - | - | - | - |
标准溶液 | - | - | - | - | 50 | |
蒸馏水 | - | - | - | - | - | 50 |
试剂一 | 250 | 350 | 300 | 400 | 350 | 350 |
试剂二 | 50 | - | 50 | - | - |
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