柠檬酸合酶（CS）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
产品组成：
试剂名称/规格 | 10T | 25T | 50T | 保存条件 |
提取液 | 液体 5 mL×1 瓶 | 液体 15 mL×1 瓶 | 液体 25 mL×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂一 | 液体 2.5 mL×1 瓶 | 液体 2.5 mL×1 瓶 | 液体 5 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 液体 0.1 mL×1 支 | 液体 0.2 mL×1 支 | 液体 0.3 mL×1 支 | -20℃保存 |
试剂三 | 液体 25 mL×1 瓶 | 液体 45 mL×1 瓶 | 液体 90 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂四 | 液体 1mL×1 支 | 液体 2mL×1 瓶 | 液体 4mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂五 | 粉剂×1 支 | 粉剂×2 支 | 粉剂×4 支 | -20℃保存 |
试剂六 | 粉剂×1 支 | 粉剂×1 支 | 粉剂×2 支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂五：临用前加入 500 μL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存；
2、试剂六：临用前加入 1.5 mL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。
产品说明：
CS（EC 2.3.3.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，是三羧酸循环第一个限速酶， 是三羧酸循环主要调控位点之一。
CS催化乙酰CoA和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使DTNB转变成黄色的TNB，在412nm处有特征吸光值。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、研钵/匀浆器、可调节移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
a、称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 提取液和 10μL 试剂二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
b、将匀浆液 600g，4℃离心 5min。将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
c、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 CS。
d、在沉淀中加入 200μL 试剂一和 2μL 试剂二，反复吹打充分混匀，用于 CS 测定，并用于蛋白浓度测定。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。
2、试剂三置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）水浴中预热10min左右（保证无沉淀）。
3、操作表：在1mL玻璃比色皿中分别加入
试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 |
试剂三 | 860 | 930 |
试剂四 | 35 | 35 |
试剂五 | 35 | - |
样本 | 35 | 35 |
试剂六 | 35 | - |
将上述试剂按顺序加入 1mL 玻璃比色皿中，加试剂六的同时开始计时，记录 412nm 波长下 10 秒时的初始吸光度 A1，之后迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴中准确反应 2 分钟；迅速取出比色皿并擦干，412nm 下记录 2 分 10 秒时的吸光度 A2，，并计算测定管的 ΔA1=A2-A1，对照管的ΔA1’=A2-A1
