α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体 60 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 液体 0.6 mL×1 支 | -20℃保存 |
试剂三 | 液体 55 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1 支 | 4℃保存 |
试剂五 | 粉剂×1 支 | 4℃保存 |
试剂六 | 粉剂×1 支 | -20℃保存 |
试剂七 | 粉剂×1 支 | -20℃保存 |
试剂八 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂八：临用前加入 2 mL 双蒸水充分混匀待用，用不完的试剂仍-20℃避光保存。
2、工作液的配制：临用前把试剂四、试剂五、试剂六、试剂七转移到试剂三中混合溶解待用。
产品说明：
α-KGDH（EC 1.2.4.2）广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一， 催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A。
α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、二氧化碳和NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
称取约 0.1g 组织或收集约 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10μL 试剂二，冰浴用匀浆器或研钵充分研磨，
4 ℃ 11000g 离心 10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，蒸馏水调零。
2、空白管：
取1mL工作液加入1mL石英比色皿，37℃孵育5min后取出比色皿，再依次加入40μL试剂八和60μL蒸馏水，混
匀并立即测量340nm处0s的吸光值A1，37℃准确反应2min，记录340nm处2min时的吸光值A2，计算ΔA空白=A2-A1。
3、测定管：
取1mL工作液加入1mL石英比色皿，在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min后取出比色皿，再依次加入40μL试剂八和60μL样本，混匀并立即测量340nm处0s的吸光值A3，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种） 中准确反应2min，记录340nm处2min时的吸光值A4，计算ΔA测定=A4-A3。
三、α-KGDH活性计算：
- 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
α-KGDH活性（U/mg prot）=[(ΔA测定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反总×109]÷(Cpr×V样) ÷T
=1473.7×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr
- 按样本质量计算
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
α-KGDH活性（U/g 质量）=[(ΔA测定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反总×109]÷(V样÷V样总×W)÷T
=1488.5×(ΔA测定-ΔA空白)÷W
- 按细菌或细胞数量计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
α-KGDH活性（U/104 cell）=[(ΔA测定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反总×109]÷(V样÷V样总×500) ÷T
=2.977×(ΔA测定-ΔA空白)
V反总：反应体系总体积，1.1×10-3 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.06mL；V样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
注意事项：
1、测定过程中所有试剂和样本在冰上放置，以免变性和失活。
2、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水，将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
4、测定管的 ΔA 值在 0.01-0.25 之间，若测定管的 ΔA 值大于 0.25，需将样本进行稀释。
5、由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约 1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
