异柠檬酸裂解酶（ICL）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法

溶液的配制：

1、提取液：临用前将试剂七加入到提取液中，勿放于-20℃；

2、试剂三：临用前取 1 瓶加入 6.25mL 蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂-20℃分装保存 2 周，避免反复冻融；

3、试剂四：临用前取 1 瓶加入 6.6mL 蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂-20℃分装保存 2 周，避免反复冻融；

4、试剂五：使用前需先离心。根据用量按照试剂五:蒸馏水为 1:8 的体积比例充分混匀，现用现配；

5、工作液配制：按试剂一：试剂二：试剂三：试剂四：试剂五=145:175:210:210:15 的比例将各试剂混合后备用（共 755μL，1T 的量），根据样本数量现用现配。

产品说明：

ICL（EC4.1.3.1）主要存在于植物和微生物中，油料作物种子在萌发过程中，通过乙醛酸循环及其他过程将脂肪转变成碳水化合物。ICL是乙醛酸循环的关键酶之一。

ICL催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在340nm

下有特征吸收峰，监测340nm吸光度的减小速率可间接反应ICL活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

1、细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液， 超声波破碎细菌或细胞（功率 200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），15000g，4℃，离心 20 分钟，取上清，置冰上待测。

2、组织处理：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆；15000g，4℃，离心 20 分钟，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1. 紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2. 样本测定

将上述试剂按顺序加入 1mL 石英比色皿中，加试剂六的同时开始计时，在 340nm 波长下记录 10 秒时的初始吸光度 A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴中准确反应2 分钟；迅速取出比色皿并擦干，340nm 下比色，记录 2 分 10 秒时的吸光度 A2，计算 ΔA=A1-A2。

三、ICL 活性计算

1、组织中ICL活力的计算：

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ICL（U/mg prot）=ΔA ÷（ε×d）×V反总×109÷(V样本×Cpr) ÷T=2297×ΔA÷Cpr

1. 按样本质量计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ICL（U/g 质量）=ΔA ÷（ε×d）×V反总×109÷(W÷V提取×V样本) ÷T=2297×ΔA÷W

V反总：反应总体积，1.0×10-3L；V样本：加入样本体积，0.035mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm； d：1mL石英比色皿光径，1cm；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V提取：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；T： 反应时间，2min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

2、细菌或培养细胞中ICL活力的计算：

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ICL（U/mg prot）=ΔA ÷（ε×d）×V反总×109÷(V样本×Cpr) ÷T=2297×ΔA÷Cpr

1. 按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ICL（U/104 cell）=ΔA ÷（ε×d）×V反总×109÷(500÷V提取×V样本) ÷T=4.59×ΔA

V反总：反应总体积，1.0×10-3L；V样本：加入样本体积，0.035mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm； d：1mL石英比色皿光径，1cm；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V提取：加入提取液体积，1mL；500：细菌或细 胞数量，500万；T：反应时间，2min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。