辅酶Ⅰ NAD(H)含量检测试剂盒说明书可见分光光度法

溶液的配制：

1、试剂三：需要严格避光；

2、试剂六：72 mL 乙醇和 3 mL 蒸馏水混合，备用；

3、NAD 标准品：临用前加入 1.5 mL 蒸馏水，即 2 μmol/mL，将其稀释为 1.25 nmol/mL 的 NAD 标准溶液备用；

4、NADH 标准品：临用前加入 1.4 mL 蒸馏水，即 2 μmol/mL，将其稀释为 1.25 nmol/mL 的 NADH 标准溶液备用。

产品说明：

辅酶 I 包括还原型和氧化型两种形式，在生物氧化中起传递氢的作用。氧化型辅酶 I 又称烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是脱氢酶的辅酶，它在糖酵解、糖异生、三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。中间产物会将脱下的氢递给 NAD，使之成为 NADH（还原型辅酶 I）。而 NADH 则会作为氢的载体，在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式，合成 ATP。NAD(H)在机体内有重要的生理意义，与物质代谢、能量代谢、抗细胞衰老、抗氧化以及一些疾病的发生密切相关。体内辅酶 I 含量降低会导致细胞损伤或衰亡。

分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+和NADH，NADH 通过PMS 的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在 570nm 下检测吸光值， NAD+可被乙醇脱氢酶还原为 NADH，进一步采用 MTT 还原法检测。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、NAD+和 NADH 的提取（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、血清（浆）中 NAD+和 NADH 的提取：

NAD+的提取：取 0.1mL 血清（浆），加入 0.5mL 酸性提取液，煮沸 5min (盖紧，以防止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min；取上清 200μL，加入等体积碱性提取液；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，冰上保存待测。

NADH 的提取：取 0.1mL 血清（浆），加入 0.5mL 碱性提取液，煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min，取上清 200μL，加入等体积酸性提取液；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清, 冰上保存待测。

2、组织中 NAD+和 NADH 的提取：

NAD+的提取：称取约 0.1g 组织，加入 0.5mL 酸性提取液，冰浴研磨，煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)， 冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min，取上清 200μL，加入等体积碱性提取液混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清, 冰上保存待测。

NADH 的提取：称取约 0.1g 组织，加入 0.5mL 碱性提取液，冰浴研磨，煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)， 冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min，取上清 200μL，加入等体积酸性提取液混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清, 冰上保存待测。

3、细胞或细菌中 NAD+和 NADH 的提取：

NAD+的提取：收集 500 万细胞或细菌，加入 0.5mL 酸性提取液，超声波破碎 1min（强度 20％或 200W，超声 2s，停 1s），煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min，取上清液 200uL 至另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上保存待测。 NADH 的提取：收集 500 万细胞或细菌，加入 0.5mL 碱性提取液，超声波破碎 1min（强度 20％或 200W，超声 2s，停 1s），煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min，取上清液 200uL 至另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上保存待测。

二、测定步骤

1、分光光度计预热30分钟以上，调节波长至570nm，蒸馏水调零。

2、操作表（在1.5mL棕色EP管中按下表依次加样）