磷酸果糖激酶（PFK）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

溶液的配制：

1、试剂二：临用前加入 2.8 mL 双蒸水充分溶解备用；-20℃分装保存一周；

2、试剂三：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据用量按照试剂三:蒸馏水为 2:13 的体积比例充分混匀， 现用现配；用不完的试剂三原液建议-20℃分装保存，避免反复冻融；

3、试剂四：液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据用量按照试剂四:蒸馏水为 4:65 的体积比例充分混匀， 现用现配；

4、PFK 工作液（可测 25 个样）的配制：取 19 mL 试剂一和 1.26 mL 试剂二充分混匀，现用现配。

产品说明：

PFK（EC 2.7.1.11）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，负责将果糖-6-磷酸和ATP转化为果糖-1,6

二磷酸和ADP，是糖酵解过程的关键调节酶之一。

PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PFK活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细菌、细胞或组织样本的制备

细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液， 超声波破碎细菌或细胞（功率 20%，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织处理：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、操作表：

将上述试剂按顺序加入 1mL 石英比色皿中，加样本的同时开始计时；在 340nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴中，准确反应 10 分钟；迅速取出比色皿并擦干，340nm 下比色，记录 10 分 20 秒时的吸光度 A2，计算 ΔA=A1-A2。

三、PFK 活力单位的计算

1、血清（浆）PFK 活力的计算：

单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-

二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。PFK（U/mL）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109] ÷V 样÷T=450×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 PFK 活力的计算：

1. 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-

二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。

PFK（U/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109] ÷(Cpr×V 样)÷T=450×ΔA ÷Cpr

1. 按样本质量计算

单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。

PFK（U/g 质量）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T=450×ΔA ÷W

1. 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。

PFK（U/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109] ÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.9×ΔA

V 反总：反应体系总体积，8.4×10-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.03mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

注意事项：

1、测定过程中试剂三、试剂四和样本在冰上放置，以免变性和失活。

2、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水，将此烧杯放入

37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

4、若 ΔA 大于 0.5，需将酶液用酶提取液稀释，使 ΔA 小于 0.5，可提高检测灵敏度。