谷胱甘肽 S-转移酶（GST）活性检测试剂盒说明书（紫外分光光度法）

产品组成：

溶液配制：
试剂三：临用前加 5 mL 蒸馏水溶解。
产品说明：
谷胱甘肽 S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）是一种具有多种生理功能的蛋白质家族，主要存在于细胞质内。GST 是体内解毒酶系统的重要组成部分，主要催化各种化学物质及其代谢产物与 GSH 的巯基共价结合， 使亲电化合物变为亲水物质，易于从胆汁或尿液中排泄，达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。因此， GST 在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。此外，因为 GST 具有 GSH-Px活性，亦称为 non-Se GSH-Px，具有修复氧化破坏的大分子如 DNA、蛋白质等的功能。注意，GST 催化的反应减少 GSH 含量，但是不增加 GSSG 含量。
GST 催化 GSH 与 CDNB 结合，其结合产物的光吸收峰波长为 340nm；通过测定 340nm 波长处吸光度上升速率，即可计算出 GST 活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外-可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、研钵/匀浆器、1mL 石英比色皿和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一） 进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体：直接测定。
二、测定步骤
1. 分光光度计预热 30 min 以上，调节波长到 340 nm，用蒸馏水调零。
2. 试剂二放在 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）保温。
3. 空白管：取 1mL 石英比色皿，加入 100μL 试剂一，900μL 试剂二和 100μL 试剂三，迅速混匀后于 340nm 测定 10s
吸光度记 A1，25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）水浴 5min 后，快速取出测定吸光度记 A2。
4. 测定管：取 1mL 石英比色皿，加入 100μL 上清液，900μL 试剂二和 100μL 试剂三，迅速混匀后于 340nm 测定 10s
吸光度记 A3，25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）水浴 5min 后，快速取出测定吸光度记 A4。
三、GST 活性计算
（1） 按蛋白浓度计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化 1μmol CDNB 与 GSH 结合为一个酶活性单位。GST（U/mg prot）=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷（ε×d）×106×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷Cpr
（2） 按样本质量计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每克样本每分钟催化 1μmol CDNB 与 GSH 结合为一个酶活性单位。GST（U/g 质量）=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T
=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷W
（3） 按细胞数量计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每 104 个细胞每分钟催化 1μmol CDNB 与 GSH 结合为一个酶活单位。
GST（U/104 cell）=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷（ε×d）×106×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T
=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)] ÷细胞数量
（4） 按液体体积计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫升液体每分钟催化 1μmol CDNB 与 GSH 结合为一个酶活单位。GST（U/mL）=[(A4-A3)-(A2-A1)]÷（ε×d）×106×V 反总÷V 样÷T=0.23×[(A4-A3)-(A2-A1)]
ε：产物摩尔消光系数，9.6×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；106：单位换算系数，1mol=1×106μmol；V 反总：反应体系总体积，1100μL=0.0011 L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V 样：加入反应体系中上清液体积，100μL=0.1 mL；T：反应时间，5min；W：样本质量，g；V 样总：试剂一体积，1 mL； 细胞数量：以 104 为单位，万。
注意事项：
1. 样本处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力；
2. 细胞中 GST 活性测定时，细胞数目须在 300 万-500 万之间，细胞中 GST 的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞；
3. 若样本测定吸光度大于 1，建议对样本用蒸馏水稀释，计算时结果乘以稀释倍数；
4. 测定反映的温度对测定结果有影响，请控制在 25℃或者 37℃（哺乳动物）。