外切 β-1,4-葡聚糖酶/纤维二糖水解酶（C1）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法

产品组成：

溶液的配制：
1、试剂一：临用前取 1 瓶加入 7 mL 蒸馏水溶解备用，现用现配；用不完的试剂 2-8℃保存 4 周；
2、标准品：5 μmol/mL 对硝基苯酚溶液。
产品说明：
β-1,4-葡聚糖酶/纤维二糖水解酶（C1，EC3.2.1.91）存在于细菌、真菌和动物体内，是微生物纤维素降解酶系的主要组分，也是水解天然纤维素的必需组分，C1 酶作用于纤维素线状分子的末端，水解 β-葡萄糖苷键，每次切下 1 个纤维二糖分子。
C1 能够催化对硝基苯纤维二糖苷 （PNPC）生成对硝基苯酚，后者在 400 nm 有特征光吸收。
C1
P-Nitrophenyl β-D-Cellobioside P-Nitrophenol (400nm)

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、天平、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、1 mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP 管和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照组织质量（g）︰提取液体积（mL）为 1︰5~10 的比例（建议称取 0.1 g 组织，加入 1 mL 提取液）进行冰浴匀浆。然后 10000g，4℃离心 10 min，取上清置冰上待测。
2、细菌、真菌：按照细胞数量 104 个︰提取液体积（mL）500~1000 : 1 的比例（建议 500 万细胞加入 1 mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 200W，超声 3s，间隔 7s，总时间 3 min），然后 10000g，4℃，离心 10 min，取上清置冰上待测。
3、血清（浆）等液体：直接测定。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30 min 以上，调节波长至 400 nm，蒸馏水调零。
2、标准溶液的稀释： 取 50μL 5 μmol/mL 对硝基苯酚溶液， 加入 950μL 蒸馏水， 充分混匀， 配制成 0.25
μmol/mL 标准液使用，现用现配。（实验中每管需要 100μL，为减小实验误差，故配制大体积。）
3、操作表（在 1.5 mL 离心管中依次加入下列试剂）：

涡旋混匀后室温放置 2 min，测定 400 nm 的吸光度，分别记为 A 测定管、A 对照管、A 标准管、A 空白管。计算 ΔA 测定=A 测定管-A 对照管，ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。每个测定管需设一个对照管。标准管和空白管只需测 1-2 次。

三、C1 酶活计算
1、按照样本蛋白浓度计算
酶活定义：每 mg 蛋白在反应体系中每小时生成 1 nmol 对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
C1（U/mg prot）=ΔA 测定÷（ΔA 标准÷C 标）×1000×V 样÷（Cpr×V 样）÷T=250×ΔA 测定÷ΔA 标准÷Cpr 2、按照样本质量计算
酶活定义：每 g 样本在反应体系中每小时生成 1 nmol 对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
C1（U/g 质量）= ΔA 测定÷（ΔA 标准÷C 标）×1000×V 样÷(V 样÷V 样总×W)÷T=250×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W 3、按照细菌或真菌数量计算
酶活定义：每 104 个细菌或真菌在反应体系中每小时生成 1 nmol 对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。C1（U/104 cell）= ΔA 测定÷（ΔA 标准÷C 标）×1000×V 样÷（细菌或真菌数量×V 样÷V 样总）÷T
=250×ΔA 测定÷ΔA 标准÷细菌或真菌数量
4、按液体体积计算
酶活定义：每毫升液体在反应体系中每小时催化生成 1 nmol 对硝基苯酚为一个酶活力单位。C1（U/mL）= ΔA 测定÷（ΔA 标准÷C 标）×1000×V 样÷V 样÷T=250×ΔA 测定÷ΔA 标准
C 标：标准溶液浓度：0.25 μmol/mL；V 样：加入的样本体积，0.1 mL；V 样总：加入的提取液体积，1 mL；Cpr： 上清液蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，1 h；细菌或真菌数量：以万计；W：样本质量，g；1000：换算系数，1 μmol=1000 nmol。
注意事项：
1、若吸光度大于 1 时，建议将样本用提取液稀释后进行测定。计算公式乘以稀释倍数。