己糖激酶（HK）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

溶液的配制：

1、试剂二：临用前加入 30 mL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂 4℃保存一周；

2、试剂四：用时每支加入 4 mL 双蒸水充分溶解备用，用不完的试剂 4℃保存一周；

3、试剂五：用时每支加入 2 mL 双蒸水充分溶解备用，用不完的试剂 4℃保存一周；

4、试剂六：用时取 1 支加入 125 μL 试剂一和 125 μL 蒸馏水充分溶解备用，用不完的试剂 4℃保存一周。

产品说明：

HK广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是葡萄糖分解过程中的第一个关键酶，催化葡萄糖转化为6-

磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。

HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH，NADPH在340nm有特征吸收峰。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500-1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20%200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1：5-10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、将试剂一、二、三、四和五置于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）预热10min。

3、加样表：

将上述试剂按顺序加入 1mL 石英比色皿中，立即混匀，加样本的同时开始计时，在 340nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴或恒温箱中，准确反应 5 分钟；迅速取出比色皿并擦干，340nm 下比色，记录 5 分 20 秒时的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。

三、HK 活性计算

1. 血清（浆）HK活力的计算：

单位的定义：每毫升血清（浆）在每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。HK（U/mL）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=1113×ΔA

1. 组织、细菌或细胞中HK活力计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。HK（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1113×ΔA÷Cpr

1. 按样本质量计算：

单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。HK（U/g 质量）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=1113×ΔA÷W

1. 按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。HK（U/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=2.226×ΔA

V反总：反应体系总体积，1.038×10-3L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.03mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W： 样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

注意事项：

1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三、四、五、六按比例配成混合液，预热 10min。

2、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水，将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。