β-1,3 葡聚糖酶（β-1,3-GA）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法

产品组成：

溶液的配制：
1. 试剂一：临用前取 1 支加 1.6 mL 蒸馏水溶解，用不完的试剂 2-8℃保存 4 周；
2. 标准品：10 mg 无水葡萄糖。临用前加入 1 mL 蒸馏水溶解，配制成 10 mg/mL 葡萄糖溶液备用，2-8℃保存 2 周。
产品说明：
β-1,3-GA( EC 3.2.1.73)主要存在植物中，催化β-1,3-葡萄糖苷键水解。在植物染病或处于其他逆境条件下，可诱导细胞大量合成β-1,3-GA，因此 β-1,3-GA 活性测定广泛应用于植物病理和逆境生理研究。
β-1,3-GA 水解昆布多糖，内切 β-1,3-葡萄糖苷键，产生还原末端，通过测定还原糖生成速率，来计算其酶活性。
β-1,3-GA
Fucoidan Reducing Sugar

Reducing Sugar+3,5-Dinitrosalicylic Acid 3-Amino-5-Nitrosalicylate（540nm）
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2. 细菌或细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液， 超声波破碎细菌或细胞（功率 200w 超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。
2、标准品的准备：将标准品用蒸馏水稀释至 1、0.8、0.6、0.4、0.2mg/mL。
3、标准品稀释表

实验中每个标准管需 100μL 标准溶液。
4、 样本测定（在 1.5mL EP 管中依次加入下列试剂）

充分混匀，沸水浴 5min（盖紧，防止水分散失），流水冷却，540nm 处记录各管吸光值A，ΔA=A 测定-A 对照。每个测定管需设一个对照管。标准曲线和空白管只需做 1-2 次。
如果吸光值大于 2，可以用提取液对样本稀释后测定（计算公式乘以相应稀释倍数）。

三、β-1,3-GA 活性计算
1、标准曲线的建立：
根据标准管吸光度x（A 标准管-A 空白管）和浓度（y，mg/mL）建立标准曲线，将 ΔA 带入公式中计算出样本中产生的还原糖的含量y 值（mg/mL）。
2、β-1,3-GA 活性计算：
(1) 按蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每小时产生 1mg 还原糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-GA (U/mg prot)=(y×V1)÷(V1×Cpr)÷T=y÷Cpr
(2) 按样本质量计算
单位的定义：每g 组织每小时产生 1mg 还原糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-GA (U/g 质量)=(y×V1)÷(W×V1÷V2)÷T= y÷W
(3) 按细菌或细胞数量计算
单位的定义：每 1 万个细胞或细菌每小时产生 1mg 还原糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-GA (U/104 cell)=( y×V1)÷(500×V1÷V2)÷T=0.002×y
V1：加入反应体系中样本体积，0.1mL；V2：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W： 样本质量，g；T：反应时间，60min=1h；500：细菌或细胞总数，万。