中性木聚糖酶（NEX）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法

产品组成：

溶液的配制：
标准品：10mg 木糖。临用前加入 667μL 蒸馏水配成 100μmol/mL 的标准品溶液，2-8℃保存两周。
产品说明：
木聚糖酶(EC 3.2.1.8)主要由微生物产生，能催化水解木聚糖，也被称为戊聚糖酶或半纤维素酶，可分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及 β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，因而广泛的应用于酿造和饲料工业中，中性木聚糖酶（NEX）一般分离自最适生长 pH 为 6-8 的微生物。
NEX 在中性环境中催化木聚糖降解成还原性寡糖和单糖，在沸水浴条件下进一步与 3,5-二硝基水杨酸发生显色反应，在 540nm 处有特征吸收峰，反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，通过测定反应液在 540nm
吸光值增加速率，可计算NEX 活力。
NEX
Xylan Reducing Sugar

Reducing Sugar+3,5-Dinitrosalicylic Acid 3-Amino-5-Nitrosalicylate（540nm）
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
低温离心机、可见分光光度计、水浴锅、1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、细胞或微生物样本发酵液的制备：发酵液于 8000rpm，4℃，离心 15min，取上清，置于冰上待测。
2、组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 缓冲液，冰上充分研磨。8000g，4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。
3、酶干粉：称约 1mg，加缓冲液 1mL，震荡充分溶解。

二、测定步骤
1、可见分光光度计预热30min 以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。
2、标准品稀释：取20μL 100μmol/mL木糖标准液，加入980μL蒸馏水，充分混匀，配制成2μmol/mL的木糖标准液备用，现用现配。（实验中每管需要200μL，为减小实验误差，故配制大体积。）
3、将上清液/酶溶液用蒸馏水稀释十倍后置冰上待测（即取50μL上清液/酶溶液，加入450μL蒸馏水，充分混匀）。
4、样本测定：

三、NEX计算公式
1. 发酵液 NEX 活力计算：
酶活定义：50℃，pH6.0 条件下每毫升发酵液每分钟分解木聚糖产生 1μmol 还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。
NEX 活力（U/mL）=[ΔA 测定÷(ΔA 标准÷C 标准) ]÷T=0.067×ΔA 测定÷ΔA 标准
2. 酶干粉NEX 活力计算：
酶活定义：50℃，pH6.0 条件下，每毫克酶每分钟分解木聚糖产生 1μmol 还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。
NEX 活力（U/mg）=[ΔA 测定÷(ΔA 标准÷C 标准) ] ×V 样本×10÷(V 样本×W 酶÷V 提取)÷T
=0.67×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W 酶
3. 组织中NEX 活力的计算：
（1） 按样本蛋白浓度计算：
酶活定义：50℃，pH6.0 条件下，每 mg 组织蛋白每分钟分解木聚糖产生 1μmol 还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。
NEX 活力（U/mg prot）=[ΔA 测定÷(ΔA 标准÷C 标准) ] ×V 样本×10÷(V 样本×Cpr)÷T
=0.67×ΔA 测定÷ΔA 标准÷Cpr
（2） 按样本质量计算：
酶活定义：50℃，pH6.0 条件下，每 g 组织每分钟分解木聚糖产生 1μmol 还原糖所需的酶量为一个中性木聚糖酶的活力单位。
NEX 活力（U/g 质量）=[ΔA 测定÷(ΔA 标准÷C 标准) ] ×V 样本×10÷(V 样本×W÷V 提取) ÷T
=0.67×ΔA 测定÷ΔA 标准÷W

C 标准：木糖标准溶液，2μmol/mL；V 样本：加入的样本体积，0.2mL；W 酶：酶干粉的质量，mg；T：反应时间，30min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：组织样本质量，g；V 提取：加入缓冲液的体积，1mL；10： 样本稀释倍数。
注意事项：
吸光度变化应该控制在 0.01~1.5 之间，否则加大样本量或稀释样本，注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变；也可以延长或者缩短反应时间。