酸性木聚糖酶（ACX）活性检测试剂盒说明书（可见分光光度法）
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
缓冲液 | 液体 75 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体 4 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体 15 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体 5mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 粉剂×1 支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂一：临用前加入 12mL 蒸馏水使用，2-8℃保存 3 个月。
2、标准品：10mg 木糖。临用前加入 667μL 缓冲液配成 100μmol/mL 的标准品溶液，2-8℃保存 8 周。
产品说明：
木聚糖酶(EC 3.2.1.8)主要由微生物产生，能催化水解木聚糖，也被称为戊聚糖酶或半纤维素酶，可分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及 β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，因而广泛的应用于酿造和饲料工业中，酸性木聚糖（ACX）一般分离自耐酸的真菌，细菌及部分霉菌。
ACX 在酸性环境下能将木聚糖降解成还原性寡糖和单糖，进一步在沸水浴条件下与 3,5-二硝基水杨酸发生显色反应，在 540nm 处有特征吸收峰，反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，通过测定反应液在 540nm
吸光值增加速率，可计算ACX 活力
ACX
Xylan Reducing Sugar
Reducing Sugar+3,5-Dinitrosalicylic Acid 3-Amino-5-Nitrosalicylate（540nm）
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
天平、低温离心机、恒温水浴锅，可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、可调式移液枪、冰、蒸馏水。
操作步骤 ：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 发酵液：发酵液于 8000rpm，4℃，离心 15min，取上清，作为待测样本。
2. 酶干粉：称约 1mg，加 1mL 缓冲液溶解，蒸馏水稀释 10 倍待测。
3. 组织样本：称约 0.1g 组织，加入 1mL 缓冲液，冰上充分研磨。8000rpm，4℃，离心 15min，取上清蒸馏水稀释 10 倍待测。
二、测定步骤
1、可见分光光度预热30min 以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。
2、标准品稀释：取20μL 100μmol/mL木糖标准液，加入980μL缓冲液，充分混匀，配制成2μmol/mL的木糖标准液备用，现用现配。（实验中每管需要200μL，为减小实验误差，故配制大体积。）
3、样本测定：（在EP管中加入下列试剂）
试剂名称（μL） | 对照管 | 测定管 | 空白管 | 标准管 |
样本 | 200 | 200 | - | - |
2μmol/mL木糖标准品 | - | - | - | 200 |
缓冲液 | 300 | 300 | 500 | 300 |
试剂一 | - | 200 | 200 | 200 |
混匀，50℃水浴中反应30min，立即沸水浴中10min灭活。（注意不要让盖子爆开，以免进水，改变了反应体系） |
试剂一 | 200 | - | - | - |
试剂二 | 300 | 300 | 300 | 300 |
试剂三 | 100 | 100 | 100 | 100 |
混匀，沸水浴中显色5min（注意不要让盖子爆开，以免进水改变了反应体系），冷却后尽快测定各管540nm 下的吸光度，分别记为A测定、A对照、A标准、A空白。空白管和标准管只需做1-2次。 |
三、ACX活性计算
1、发酵液ACX 活力计算：
酶活定义：50℃，pH4.8 条件下，每毫升发酵液每分钟分解木聚糖产生 1μmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX 活力（U/mL）= C 标准×（A 测定-A 对照）÷（A 标准-A 空白）÷T
= 0.067×（A 测定-A 对照）÷（A 标准-A 空白）
C 标准：木糖标准溶液浓度，2μmol/mL；T：反应时间，30min。
2、酶干粉ACX 活力计算：
酶活定义：50℃，pH4.8 条件下，每毫克酶每分钟分解木聚糖产生 1μmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX 活力（U/mg）= 10×C 标准×（A 测定-A 对照）÷（A 标准-A 空白）×V 提取÷W1÷T
= 0.67×（A 测定-A 对照）÷（A 标准-A 空白）÷W1
10：样本稀释倍数，10 倍；C 标准：木糖标准溶液浓度，2μmol/mL；V 提取：加入缓冲液体积，1mL；W1： 酶干粉重量，mg；T：反应时间，30min。
3、组织中ACX 活力计算：
（1） 按样本蛋白浓度计算：
酶活定义：50℃，pH 4.8 条件下，每 mg 组织蛋白每分钟分解木聚糖产生 1μmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX 活力（U/mg prot）= 10×C 标准×（A 测定-A 对照）÷（A 标准-A 空白）×V 样本÷(V 样本×Cpr)÷T
= 0.67×（A 测定-A 对照）÷（A 标准-A 空白）÷Cpr
（2） 按样本质量计算：
酶活定义：50℃，pH4.8 条件下，每克组织每分钟分解木聚糖产生 1μmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX 活力（U/g 质量）= 10×C 标准×（A 测定-A 对照）÷（A 标准-A 空白）×V 提取÷W2÷T
= 0.67×（A 测定-A 对照）÷（A 标准-A 空白）÷W2
10：样本稀释倍数，10 倍；C 标准：木糖标准溶液浓度，2μmol/mL；V 提取：加入缓冲液体积，1mL；W2： 样本质量，g；T：反应时间，30min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V 样本：加入的样本量，0.2mL。
注意事项：
吸光度变化应该控制在 0.01~1.2 之间，否则加大样本量或稀释样本，注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变。
