海藻糖酶（THL）活性检测试剂盒说明书（可见分光光度法）
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 50mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体 30mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 粉剂×2 支 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体 30mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂四 | 液体 30mL×1 瓶 | 常温保存 |
标准品 | 粉剂×1 支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1. 试剂二：临用前取 1 支加入 1.2mL 试剂一，充分溶解待用，用不完的试剂 2-8℃保存 1 周；
2. 标准品：含 10mg 无水葡萄糖（干燥失重<0.2%），临用前加入 1mL 蒸馏水溶解，配制成 10mg/mL 标准液待用，4℃可保存 2 周，或者用饱和苯甲酸溶液溶解，2-8℃保存 4 周；
产品说明：
THL（EC3.2.1.28）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。海藻糖酶主要功能在于生物体分解海藻糖生成葡萄糖而直接用于能量供应。
采用3,5－二硝基水杨酸法测定THL催化海藻糖产生的还原糖的含量。还原糖与3,5－二硝基水杨酸共热生成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比，由此判断THL活性的高低。
Alkalinity, Heating
ReducingSugar+DNS 3- Amino-2-Hydroxy-5-NitrobenzoicAcid
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、超声破碎仪、低温离心机、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、细菌或细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎，（冰浴，功率 200W，超声开 3 秒，关 10 秒，重复 30 次）；8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织的处理：称取约 0.1g 组织加入 1mL 提取液，冰浴中匀浆。8000g，4℃下离心 10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）的处理：吸取0.1mL血清（浆），加入0.9mL提取液，冰浴中匀浆。8000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。
2、 将 10mg/mL 标准液用蒸馏水稀释至 1、0.8、0.6、0.4、0.2mg/mL，现用现配，标准液稀释可参考下表。
序号 | 稀释前浓度（mg/mL） | 标准液体积（μL） | 蒸馏水体积（μL） | 稀释后浓度（mg/mL） |
1 | 10 | 100 | 900 | 1 |
2 | 1 | 160 | 40 | 0.8 |
3 | 1 | 120 | 80 | 0.6 |
4 | 1 | 80 | 120 | 0.4 |
5 | 1 | 40 | 160 | 0.2 |
备注：实验中每个标准管需 180μL 标准溶液。
3、 样本测定（在 1.5mLEP 管中依次加入下列试剂）：
试剂名称（μL） | 对照管 | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 180 | 180 | - | - |
标准液 | - | - | 180 | - |
蒸馏水 | - | - | | 180 |
试剂一 | 300 | 220 | 300 | 300 |
试剂二 | - | 80 |
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