山梨醇脱氢酶（SDH）活性检测试剂盒说明书（可见分光光度法）
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 60 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 粉剂×5 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体 12mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体 12mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂四 | 粉剂×5 支 | -20℃保存 |
试剂五 | 液体 55 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 粉剂×1 支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂一：取 10 mL 试剂五加入 1 瓶试剂一粉剂中溶解，再加入一支试剂四，现用现配，24 h 变质；
2、 标准品：临用前加入 1.4 mL 蒸馏水，即 10 μmol/mL NADH 标准品。-20℃保存 4 周，避免反复冻融。
产品说明：
SDH（EC 1.1.1.14）催化山梨醇脱氢生成果糖，是调控生物体内山梨醇含量的关健酶之一。SDH 催化山梨醇脱氢生成果糖，同时还原 NAD+生成 NADH，生成的 NADH 能将电子传递给 NBT 生成紫色的甲臜，根据这一原理可以计算 SDH 活性。
SDH
Sorbitol + NAD+ NADH + H+ + Fructose
H+ + PMS + NBT Formazan （570nm）
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、超声破碎仪，1mL玻璃比色皿、研钵/ 匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积
（mL）为 500~1000：1 的比例加入提取液（建议 500 万细菌或细胞加入 1 mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000×g 4℃离心 10 min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1 g 组织，加入 1 mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000 ×g 4℃离心 10 min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样本：直接检测。
二、测定步骤
1、可见分光光度计预热 30 min 以上，调节波长至 570 nm，蒸馏水调零。
2、标准管的测定：将 10 μmol/mL NADH 标准品用水稀释至 1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3 μmol/mL 的标准溶液
（1） 标准品稀释表
序号 | 稀释前浓度（μmol/mL） | 标准液体积（μL） | 蒸馏水体积（μL） | 稀释后浓度（μmol/mL） |
1 | 10 | 100 | 900 | 1 |
2 | 1 | 180 | 20 | 0.9 |
3 | 1 | 160 | 40 | 0.8 |
4 | 1 | 140 | 60 | 0.7 |
5 | 1 | 120 | 80 | 0.6 |
6 | 1 | 100 | 100 | 0.5 |
7 | 1 | 80 | 120 | 0.4 |
8 | 1 | 60 | 140 | 0.3 |
实验中每个标准管需 100μL 标准溶液。
（2） 标准品测定表
试剂名称(μL) | 标准管 | 空白管 |
标准溶液 | 100 | - |
蒸馏水 | - |
|
