顺乌头酸酶（ACO）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

产品组成：

溶液的配制：

1、试剂三：易挥发试剂，使用后尽快拧紧盖子，密封后放入-20℃保存；

产品说明：

顺乌头酸酶（Aconitase, ACO）是细胞内一种重要的铁硫蛋白酶，主要存在于胞浆与线粒体中。ACO 催化细胞内柠檬酸经中间产物顺乌头酸生成异柠檬酸的可逆反应，对维持三羧酸循环及乙醛酸循环的顺利进行起着重要作用。

顺乌头酸酶催化异柠檬酸生成顺乌头酸，顺乌头酸在 240nm 有特征吸收峰，通过检测顺乌头酸的产生速率来

计算该酶活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、低温台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、超声波细胞破碎仪、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、顺乌头酸酶的提取（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

A、总顺乌头酸酶的提取

称取约 0.1 g 组织或收集 500 万个细胞（细菌），加入 1mL 试剂一与 10μL 试剂三，用匀浆器或研钵于冰上匀浆。将匀浆置于冰上超声波破碎（功率 300W，超声 3 秒，间隔 9 秒，重复 15 次），4℃，11000×g 离心 15min，

取上清置于冰上待测（若以蛋白浓度计算，则需留出足够量来测定蛋白浓度 Cpr1）。用于测定总顺乌头酸酶活性

（建议将样本用蒸馏水稀释 4 -10 倍后检测）。

B、胞浆与线粒体顺乌头酸酶的提取

1、称取约 0.3 g 组织或收集 1500 万个细胞，加入 1.5mL 试剂一与 15μL 试剂三，用匀浆器或研钵于冰上匀浆。

2、4℃，600×g 离心 5min。（若以蛋白浓度计算，则需留出足够量来测定蛋白浓度 Cpr2）

3、将上清液移至另一离心管中，4℃，11000×g 离心 15min。

1、紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至240nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

3、将工作液 25℃预热 15 min 以上；

4、在 1mL 石英比色皿中分别加入：

三、顺乌头酸酶活性的计算

1、总顺乌头酸酶活性计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算

酶活定义：每 mg 组织蛋白每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO 酶活(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×106]÷(V 样×Cpr1) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr1×N

1. 按样本质量计算

酶活定义：每 g 组织在反应体系中每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。ACO 酶活(U/g 质量)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×106]÷(V 样÷V 提取×W）÷T×N=561.11×ΔA÷W×N

1. 按照细菌或细胞数量计算

酶活定义：每 104 个细菌或细胞在反应体系中每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。ACO 酶活(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 6]÷(V 样÷V 提取×细胞数量(万个))÷T×N

=561.11×ΔA÷细胞数量(万个)×N

V 反总：反应体系总体积，1×10-3L；ε：顺乌头酸消光系数，3.6 L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样： 加入样本体积，0.1mL；V 提取：样本总体积，1.01mL；T：反应时间，5min；Cpr1：样本蛋白质浓度，mg/mL；106： 单位换算系数，1mmol=1×106nmol；N：稀释倍数；W：样本质量，g。

2、胞浆顺乌头酸酶活性计算：

1. 按样本蛋白浓度计算

酶活定义：每 mg 组织蛋白每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。

ACO 酶活(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×106]÷(V 样×Cpr2) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr2×N

1. 按样本质量计算

酶活定义：每 g 组织在反应体系中每分钟净生产 1nmol 顺乌头酸定义为一个酶活力单位。ACO 酶活(U/g 质量)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×106]÷(V 样÷V 提取×W）÷T×N=841.67×ΔA÷W×N