乙醛脱氢酶（ALDH）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 60 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 20 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 液体 1 mL×1 支 | 4℃保存 |
试剂四 | 液体 2 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂五 | 液体 3 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂二：临用前加入 6 mL 蒸馏水溶解，-20℃分装保存；
2、试剂五：沸点低，在使用时保持低温以保证正确的吸取量。
产品说明：
乙醛脱氢酶 (EC 1.2.1.10)是醛脱氢酶的一种，广泛存在于各种动物、植物和微生物体内。在辅酶I的存在下， 它催化乙醇在内的某些一级或二级醇、醛或酮的脱氢反应。在人类和许多动物体内，线粒体乙醛脱氢酶能把对生物体有害的醇类转化，所以在细胞解毒研究中乙醛脱氢酶受到高度关注；同时，乙醛脱氢酶在分子生物学以及相关疾病的检测方面有较广泛的研究应用。
乙醛脱氢酶催化乙醛和NAD+转化为乙酸和NADH，利用NADH在340nm处吸光值的变化即可计算得到乙醛脱氢酶的活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液） 进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 20min，取上清置于冰上待测。
细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 20min，取上清置于冰上待测。
液体：直接检测。
二、测定步骤
1、紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、将试剂一37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）预热15min。
3、操作表：
试剂名称 | 空白管 | 测定管 |
样本（μL） | | 200 |
蒸馏水（μL） | 500 | 300 |
试剂一（μL） | 300 | 300 |
试剂二（μL） | 100 | 100 |
试剂三（μL） | 20 | 20 |
试剂四（μL） | 30 | 30 |
试剂五（μL） | 50 | 50 |
在 1mL 石英比色皿中分别加入上述试剂，充分混匀后于 340nm 处测定 30s 时的吸光值 A1，迅速置于37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）水浴 1min，拿出迅速擦干测定 90s 时的吸光值 A2，计算 ΔA 测定管=A2 测定-A1 测定，ΔA 空白管=A2 空白-A1 空白，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。（空白管需做 1-2 次） |
三、ALDH酶活计算
- 按蛋白浓度计算
酶活定义：每毫克蛋白每分钟生成1nmol的NADH定义为1个酶活单位。
ALDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×Cpr）÷T=804×ΔA÷Cpr
- 按样本质量计算
酶活定义：每克样本每分钟生成1nmol的NADH定义为1个酶活单位。
ALDH酶活（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T=804×ΔA÷W
- 按细胞数量计算
酶活定义：每104个细胞每分钟生成1nmol的NADH定义为1个酶活单位。
ALDH酶活（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（V样÷V样总×细胞数量（万个））÷T
=804×ΔA÷细胞数量（万个）
- 按液体体积计算
酶活定义：每mL样本每分钟生成1nmol的NADH定义为1个酶活单位。
ALDH酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷V样÷T=804×ΔA
ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，0.001L；V样： 反应体系中样本体积，0.2mL；V样总：提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，需自行测定；W：样 本质量，g；T：反应时间：1min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
注意事项：
1、空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，其 OD 值不超过 0.3，变化不超过 0.01。
2、ΔA 大于 1 时，建议将样本稀释后再进行测定。当 ΔA
