NAD-苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 50 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 40 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×2 支 | -20℃保存 |
试剂三 | 粉剂×2 支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂二：临用前加入 360 μL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存；
2、试剂三：临用前加入 327 μL 双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。
产品说明：
MDH（EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一， 催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物，连接多条重要的代谢途径。因此，MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH，细菌中通常只含有NAD-MDH，在真核细胞中，NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中。
NAD-MDH催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致340nm处光吸收下降。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心弃上清，按照每 200 万细菌或细胞加入 400μL 提取液， 超声波破碎细菌或细胞（功率 20%，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
组织：称取约 0.05g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。血清（浆）样本：直接检测。
二、测定步骤
1、紫外分光光度计提前预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、试剂一37℃预热15min。
3、样本测定：
试剂名称（μL） | 测定管 | 空白管 |
样本 | 20 | - |
蒸馏水 | - | 20 |
试剂一 | 760 | 760 |
试剂二 | 10 | 10 |
试剂三 | 10 | 10 |
将上述试剂按顺序加入 1mL 石英比色皿中，充分吸打混匀后立即在 340nm 波长下记录初始吸光度 A1 和反应1min 后的吸光度 A2，尽量保持反应温度为 37℃。计算 ΔA=A1-A2。记录 ΔA 测定、ΔA 空白。（空白管测 1-2 管即可）
三、NAD-MDH活力单位的计算
- 血清（浆）NAD-MDH活力的计算
单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/mL）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷V样本÷T =6431×(ΔA测定-ΔA空白)
- 组织中NAD-MDH活力的计算
- 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/mg prot）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(V样本×Cpr)÷T=6431×(ΔA测定-ΔA空白) ÷Cpr
- 按样本质量计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/g 质量）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(W÷V提取×V样本)÷T=6431×(ΔA测定-ΔA空白)
÷W
- 细菌或培养细胞中NAD-MDH活力的计算
- 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/mg prot）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(V样本×Cpr)÷T=6431×(ΔA测定-ΔA空白) ÷Cpr
- 按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-MDH（U/104 cell）=(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(500×V样本)÷T=13×(ΔA测定-ΔA空白)
V反总：反应总体积，0.8mL；V样本：加入样本体积，0.02mL；V提取：提取液体积，1mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10-3mL/nmol/cm；d：比色皿光径，1cm；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；500： 细菌或细胞密度，500万/mL；W：样本质量，g。
注意事项：
1、粗酶液的提取必须在 0℃- 4℃中操做完成，以防止酶变性失活。
2、实验时，试剂二、试剂三和样本在冰上放置，以免变性和失活。
3、当初始读值小于 0.7 或者 ΔA 大于 0.5 时建议稀释后测量。
4、建议一人加样一人比色。
