产品组成:
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 30 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体 15mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体 12 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体 5mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂四 A | 粉剂×2 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂四 B | 液体 70mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 粉剂×1 支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制:
1、试剂二:此试剂为悬浊液,使用前需摇匀;
2、试剂三:饱和溶液,低温(2-8℃)条件取出会有晶体析出,60℃加热使其溶解即可;
3、试剂四:临用前取一瓶试剂四A,加入 32mL 试剂四 B 中,充分溶解,现用现配。用不完的试剂 2-8℃可以保存 4 周;
4、标准品:5mg N-乙酰氨基葡萄糖。临用前加入 1mL 试剂一配制成 5mg/mL 的标准溶液,即 5000μg/mL的标准溶液,2-8℃可以保存 4 周。
产品说明:
几丁质酶主要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨),以及真菌类的细胞壁中。而几丁质酶(EC 3.2.1.14)可催化几丁质水解,具有抵御真菌侵染的作用,成为抗真菌病害的研究热点。
几丁质酶水解几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖,N-乙酰氨基葡萄糖与碱共热产生的中间化合物可进一步与对二甲氨基苯甲醛反应产生显色物质,该显色物质在 585nm 处有特征吸收峰,吸光值增加速率反映了几丁质酶的活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 20min,取上清,置冰上待测。
2、细菌或细胞:收集细菌或细胞到离心管内,弃上清,按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),10000g,4℃离心 20min,取上清,置冰上待测。
3、液体:直接测定。(若溶液呈现浑浊,则离心取上清后再测定)
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min以上,调节波长到585nm,蒸馏水调零。
2、标准溶液的制备:将标准品用试剂一分别稀释为 100、80、40、20、10、5、2.5、1.25μg/mL 的标准溶液。
3、标准液稀释表
序号 | 稀释前浓度(μg/mL) | 标准液体积(μL) | 试剂一体积(μL) | 稀释后浓度(μg/mL) |
1 | 5000 | 100 | 400 | 1000 |
2 | 1000 | 200 | 1800 | 1000 |
3 | 100 | 800 | 200 | 80 |
4 | 80 | 500 | 500 | 40 |
5 | 40 | 500 | 500 | 20 |
6 | 20 | 500 |
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