锰过氧化物酶（Mnp）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
产品内容：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体 80mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体 6mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体 11mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂四 | 液体 200μL×1 支 | 2-8℃保存 |
溶液配制：
试剂四：临用前根据实验所需量按照试剂四（μL）：蒸馏水（μL）=1:49 的比例配制，现用现配。
产品说明：
锰过氧化物酶（Mnp）（EC1.11.1.13）是一种普遍存在于细菌和真菌中的微生物木质素分解酶，在微生物木质素分解系统中起着关键作用，它可以有效的降解木质素以及废水和土壤中比较难降解的化合物，在生物制浆、生物漂白和污染物的生物降解等工业领域具有广泛应用。
锰过氧化物酶在 Mn2+环境下，可将愈创木酚氧化为四邻甲氧基连酚，四邻甲氧基连酚在 465nm 处有吸收峰， 通过检测 465nm 处吸光值的变化，可测定锰过氧化物酶的活性
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、超声波细胞破碎仪、研钵/匀浆器、1mL 玻璃比色皿、震荡仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照样本质量（g）：试剂一体积（mL）为 1:5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆；10000g 4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
2、细菌或细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500-1000:1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一）加入试剂一，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 30%或 300W，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min），10000g 4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
3、液体样本：直接检测。若溶液浑浊则离心后取上清进行测定。
二、测定步骤
1、可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 465nm，蒸馏水调零。
2、测定前根据实验用量取出部分试剂一、试剂二、试剂三和试剂四置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其他动物）预热 10min 以上。
3、加样表（在 1mL 玻璃比色皿中依次加入下列试剂)：
试剂名称（μL） | 测定管 |
样本（μL） | 100 |
试剂一（μL） | 500 |
试剂二（μL） | 100 |
试剂三（μL） | 200 |
试剂四（μL） | 100 |
将上述试剂分别加入1mL 玻璃比色皿后迅速吹打混匀，记录第30s 的吸光值A1 以及10min30s 时的吸光值A2， 计算 ΔA =A2-A1。若一次性测定样本过多，可根据使用量将试剂一、二、三、四按 5:1:2:1 比例配成工作液后进行预热，测定时按照 100μL 样本+900μL 工作液加入 1mL 玻璃比色皿进行测定。
三、Mnp 活力的计算
1、按样本蛋白质浓度计算
酶活定义：pH4.5 条件下，每 mg 组织蛋白每分钟氧化 1nmol 愈创木酚所需的酶量为一个酶活单位。Mnp 活性（U /mg prot）= ΔA×V 反总÷(?×d)×109÷(V 样×Cpr)÷T=82.64×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算
酶活定义：pH4.5 条件下，每 g 组织每分钟氧化 1nmol 愈创木酚所需的酶量为一个酶活单位。Mnp 活性（U /g 质量）= ΔA×V 反总÷(?×d)×109÷(V 样÷V 样总×W)÷T=82.64×ΔA÷W
3、按细菌/细胞数量计算
酶活定义：pH4.5 条件下，每 104 细菌/细胞每分钟氧化 1nmol 愈创木酚所需的酶量为一个酶活单位。Mnp 活性（U /104 cell）= ΔA×V 反总÷(?×d)×109÷(V 样÷V 样总×细胞数量)÷T=82.64×ΔA÷细胞数量
4、 按照样本体积计算
酶活定义：pH4.5 条件下，每 mL 血清或液体样本每分钟消耗 1nmol 底物的酶量为一个酶活单位。
Mnp 活性（U/mL）=ΔA×V 反总÷(?×d)×109÷V 样÷T= 82.64×ΔA
ε：愈创木酚摩尔消光系数：12100 L/mol/cm；d:比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积，0.001L；V 样：加入样本体积，0.1mL，V 样总：提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，10 min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
注意事项：
当 A1 大于 1.2 或者 ΔA 大于 0.5 时，建议将样本用试剂一稀释后测定；当 ΔA 过小时，可以适当加大样本量后重新进行测定。注意同步修改计算公式。
