胞浆异柠檬酸脱氢酶（ICDHc）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 100 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×2 支 | 4℃保存 |
试剂三 | 粉剂×2 支 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂一：用时加入 50 mL 提取液溶解；
2、试剂二：用时每支加 275 μL 双蒸水充分溶解备用；
3、试剂三：用时每支加 275 μL 双蒸水充分溶解备用；
4、工作液配制：将试剂一、试剂二、试剂三按 85：1：1 的比例混合，现用现配。
产品说明：
ICDHc（EC 1.1.1.42）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化异柠檬酸脱氢脱羧生成 α-酮戊二酸，同时还原 NADP+生成 NADPH。ICDHc 是细胞质中除了磷酸戊糖途径外又一种 NADPH 重要来源，在逆境中该酶活性通常会发生显著变化。
利用 ICDHc 催化 NADP+还原成 NADPH 反应，在 340nm 下测定 NADPH 浓度的增加，即可反映 ICDHc 活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、细菌、细胞或组织样本的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 200 万细菌或细胞加入 400μL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20%，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样本：直接检测。
二、测定步骤
1、紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、按下表步骤加样：
试剂名称（μL） | 测定管 |
工作液（μL） | 950 |
样本（μL） | 50 |
将上述试剂按顺序加入 1mL 石英比色皿中，加样本的同时开始计时，在 340nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1；迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃水浴中，准确反应 2 分钟；迅速取出比色皿并擦干，记录 2 分 20 秒时的吸光度 A2。计算 ΔA=A2-A1。
三、ICDHc 活力单位的计算
1、血清（浆）ICDHc 活力的计算
单位的定义：每 mL 血清（浆）在反应体系中每分钟生成 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。ICDHc（U/mL）=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样本÷T=1608×ΔA
2、组织中 ICDHc 活力的计算
- 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。ICDHc（U/mg prot）=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样本×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr
- 按样本质量计算：
单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟生成 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。ICDHc（U/g 质量）=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V 提取×V 样本)÷T=1608×ΔA÷W
3、细菌或培养细胞中 ICDHc 活力的计算
- 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。ICDHc（U/mg prot）=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样本×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr
- 按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成 1nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。ICDHc（U/104 Cell）=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样本×500)÷T=3.2×ΔA
V 反总：反应总体积，0.001L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103L/moL/cm；d：石英比色皿光径，1cm；V 样本：加入样本体积，0.05mL；V提取：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T： 反应时间，2min；500：细菌或细胞密度，500 万/mL。
注意事项：
1、若 A2-A1 大于 0.5，需将酶液用提取液稀释，使 A2-A1 小于 0.5，可提高检测灵敏度。若初始值 A1 大于 0.5 可尝试将酶液用提取液稀释。
2、实验时，试剂二、试剂三和样本在冰上放置，以免变性和失活；工作液 37℃水浴放置。
3、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃蒸馏水，将此烧杯放入 37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
4、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
