磷酸丙糖异构酶（TPI）活性检测试剂盒说明书（微量法）
产品组成：

溶液的配制：
1、试剂二：临用前取 1 支加入 1.1mL 蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融；
2、试剂三：临用前取 1 支加入 1.1mL 蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融；
3、试剂四：提供一 8mL 棕色空试剂瓶。临用前取 1 支试剂四加入 2.5mL 蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂-20℃
分装保存 2 周，避免反复冻融。
产品说明：
植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶是光合作用中参与calvin循环的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮之间的转化，磷酸二羟丙酮能快速透过叶绿体的包膜进入细胞质，并在其中逐步转化为蔗糖。
磷酸丙糖异构酶将磷酸二羟丙酮转化为3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛与NAD在3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下生成3-磷酸甘油酸和NADH，340nm处的吸光度变化反映了磷酸丙糖异构酶的活性的高低。
Triose-Phosphateisomerase
Dihydroxyacetone Phosphate Glyceraldehyde-3-Phosphate
Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase
Glyceraldehyde-3-Phosphate + NAD Glycerate 3-Phosphate + NADH
（340nm）
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、天平、水浴锅、台式低温离心机、微量石英比色皿/96孔UV板、细胞超声破碎仪、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 总 TPI 提取：按照组织质量（g）︰提取液一体积(mL)为 1︰5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL 提取液一）进行冰浴匀浆，匀浆后冰浴超声波破碎（功率 200W，超声 3s，间隔 7s，总时间 1min），于 4℃，8000g 离心 10min，取上清，置于冰上待测。
2. 胞浆和叶绿体 TPI 的分离：
（1）按照组织质量（g）︰提取液一体积(mL)为 1︰5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL 提取液一）进行冰浴匀浆，匀浆后于 4℃，200g 离心 5min，弃沉淀，留取上清。
（2）上清于 4℃，8000g 离心 10min，取上清用于测定胞浆 TPI 活性，
（3）在第二步离心后的沉淀加 1mL 提取液二，震荡混匀后冰浴超声波破碎（功率 200W，超声 3s，间隔 7s，总时间 1min），然后 4℃，8000g 离心 10min，取上清测定叶绿体中 TPI 活性。

建议测定总 TPI 活性，按照步骤 1 提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 TPI，则按照步骤 2 提取粗酶液。
二、测定步骤
1. 紫外分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，分光光度计蒸馏水调零。
2. 试剂一预热 15min 以上。
3. 测定管：依次取 120μL 试剂一、20μL 试剂二、20μL 试剂三、20μL 试剂四和 20μL 粗酶液于微量石英比色皿或 96 孔 UV 板，迅速吹打混匀，立即记录 340nm 处 20s 的吸光值 A1，迅速置于 37℃水浴锅或培养箱 5min（酶标仪有控温功能的可以将温度调至 37℃），拿出迅速擦干测定 5min20s 时的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。
三、磷酸丙糖异构酶活性计算
A、使用微量石英比色皿测定
1. 按样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：每 mg 组织蛋白每 min 生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。TPI 活性（U/mg prot）＝(ΔA÷ε÷d)×V 反×109÷V 样÷Cpr÷T×F=321.54×ΔA÷Cpr×F
2. 按照样本质量计算
酶活单位定义：每 g 组织每 min 生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。TPI 活性（U/g 质量）＝(ΔA÷ε÷d)×V 反×109÷V 样×V 提÷W÷T×F=321.54×ΔA÷W×F
ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；109：单位换算系数，1mol=109nmol；V 反：反应总体积，2.0×10-4L；V 样：加入样本上清体积，0.02mL；V 提：加入提取液一或提取液二的体积，1mL；W： 样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，5min；F：稀释倍数。
B、使用 96 孔 UV 板测定
将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm（96孔UV板光径）进行计算即可。