酰基转移酶（AAT）活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法
产品组成：
试剂名称/规格 | 10T | 25T | 50T | 保存条件 |
提取液 | 液体 10 mL×1 瓶 | 液体 25 mL×1 瓶 | 液体 50 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 液体 10 mL×1 瓶 | 液体 25 mL×1 瓶 | 液体 50 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1 支 | 粉剂×1 瓶 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 液体 1 mL×1 支 | 液体 2.5 mL×1 瓶 | 液体 5 mL×1 瓶 | 4℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1 支 | 粉剂×1 瓶 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 |
10T 溶液的配制：
1、提取液：内含不溶物，使用前摇匀；
2、试剂二：临用前加蒸馏水 0.6 mL 充分溶解，4℃保存；
3、试剂四：临用前加入试剂一 0.6 mL 充分溶解，4℃避光保存。
25T 溶液的配制：
1、提取液：内含不溶物，使用前摇匀。
2、试剂二：临用前加蒸馏水 1.5 mL 充分溶解，4℃保存。
3、试剂四：临用前加入试剂一 1.3 mL 充分溶解，4℃保存。
50T 溶液的配制：
1、提取液：内含不溶物，使用前摇匀。
2、试剂二：临用前加蒸馏水 2.6 mL 充分溶解，4℃保存。
3、试剂四：临用前加入试剂一 2.6 mL 充分溶解，4℃保存。
产品说明：
AAT是一个多功能蛋白大家族，主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应，在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。
AAT催化乙酰CoA转移乙酰基到丁醇，同时还原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰，测定412nm吸光度增加速率，来计算AAT活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织样本：称取约 0.1g 样本加提取液 1mL，冰上充分研磨，15000g 4℃离心 20min，上清液待测。血清（浆）样本：直接检测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。
2、试剂一在37℃水浴保温20min以上。
3、样本测定：
试剂名称（μL） | 空白管 | 测定管 |
蒸馏水 | 100 | - |
上清液/血清 | - | 100 |
试剂一（预热） | 700 | 700 |
试剂二 | 50 | 50 |
试剂三 | 100 | 100 |
试剂四 | 50 | 50 |
将上述试剂按顺序加入 1mL 玻璃比色皿中，加试剂四的同时开始计时，在 412nm 波长下记录 10s 时的初始吸光度 A1 和 130s 后的吸光值 A2，计算 ΔA 空=A2 空-A1 空；ΔA 测=A2 测-A1 测，ΔA=ΔA 测-ΔA 空。
三、AAT活性计算
1、按样本蛋白浓度计算
单位的定义：37℃中每mL反应体系下每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1个酶活单位。
AAT (U/mg prot) =ΔA÷0.001÷(Cpr×V样) ÷T=5000×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
2、按样本质量计算
单位的定义：37℃中每mL反应体系下每克组织每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1个酶活单位。
AAT (U/g 质量) =ΔA÷0.001÷(V样÷V样总×W) ÷T=5000×ΔA÷W
3、按血清浓度计算
单位的定义：37℃中每mL反应体系下每mL血清每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1个酶活单位。
AAT (U/mL 血清) =ΔA÷0.001÷V样÷T=5000×ΔA
Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；V样：加入反应体系中上清液体积，0.1mL；W：样本质量，g；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，2min。
注意事项：
1、上清液蛋白质含量需要另外测定。
2、当吸光值大于1时，建议稀释后测量。
3、如果ΔA测偏低，可以延长反应时间，如测定10s和310s的吸光度，相应修改计算公式中反应时间。
