淀粉脱分支酶（DBE）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 50 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体 15 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 粉剂×2 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体 15 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂四 | 液体 42 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 粉剂×1 支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂二：临用前取 1 瓶加入 3 mL 试剂一，充分溶解后待用，用不完的试剂 2-8℃保存 4 周；
2、 标准品：10 mg 无水葡萄糖。临用前加入 1 mL 蒸馏水溶解，配成 10 mg/mL 葡萄糖溶液备用，2-8℃可保存两周。
产品说明：
淀粉脱分支酶（starch debranching enzyme，DBE）能够专一、高效的裂解支链淀粉的α-1,6-糖苷键，对淀粉的结构起“修饰”的作用，淀粉脱分支酶在调整支链淀粉侧链的链长方面起着关键作用，淀粉分支酶和淀粉脱分支酶的平衡使得支链淀粉合成。
DBE催化支链淀粉产生还原糖，其与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕红色物质，通过测定其在540nm下吸光值变化可计算得DBE活性。
DBE
Amylopectin Reducing Sugar
Reducing Sugar+3,5-Dinitrosalicylic Acid 3-Amino-5-Nitrosalicylate（540nm）
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式低温离心机、水浴锅或恒温培养箱、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照组织质量（g）︰提取液体积（mL）为 1︰5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 15000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
2、细胞或细菌：按照细胞或细菌数量（104 个）︰提取液体积（mL）为 500~1000︰1 的比例（建议 500 万个细胞或细菌加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）； 然后 15000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。（若溶液有浑浊则离心后取上清测定）
3、液体：直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。
2、 将 10mg/mL 标准液用蒸馏水稀释为 0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mg/mL 的标准溶液备用。
序号 | 稀释前浓度（mg/mL） | 标准液体积（μL） | 蒸馏水体积（μL） | 稀释后浓度（mg/mL） |
1 | 10 | 100 | 1900 | 0.5 |
2 | 0.5 | 400 | 100 | 0.4 |
3 | 0.5 | 300 | 200 | 0.3 |
4 | 0.5 | 200 | 300 | 0.2 |
5 | 0.5 | 100 | 400 | 0.1 |
实验中每个标准管需200μL 标准溶液。
3、 取 250μL 样本沸水浴 5min（盖紧，防止水分散失），冷却至室温后，8000g，常温离心 5min，取上清备用。
4、 操作表 (在 1.5mL 离心管中) ：
试剂名称（μL ） | 对照管 | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
煮沸样本 | 200 | - | - | - |
样本 | - | 200 | - | - |
标准溶液 | - | - | 200 | - |
蒸馏水 | - | - | - |
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