单宁酶活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体 75 mL×2 瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 粉剂×2 支 | 2-8℃保存 |
标准品 | 粉剂×1 支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂一：临用前取 1 支加入 1.5 mL 无水乙醇混匀溶解，用不完的试剂可以 2-8℃保存一周；
2、标准品：5 mg 没食子酸丙酯。临用前加入 1.178 mL 无水乙醇充分混匀溶解，配成 20 μmol/mL 的标准溶液，2-8℃保存两周。
产品说明：
单宁酶全称是单宁酯酰水解酶(Tannase，EC 3.1.1.20)，存在于富含单宁的植物，也广泛存在于微生物中，可以水解酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖。
使用没食子酸丙酯（PG）作为单宁酶酶促反应的底物，其在270nn下有特征吸收峰，根据其反应前后吸光度
的变化来计算单宁酶活力。
Tannase
Propyl Gallate (270nm) Gallic Acid
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、1mL石英比色皿、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、超声破碎仪、研钵/匀浆器、乙醇、 冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、细胞或细菌样本的制备：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）。10000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计预热30min，波长调至270nm，蒸馏水调零。
2、 标准液的稀释：取10μL 20μmol/mL的标准溶液，加入3990μL提取液，充分混匀，配制成0.05μmol/mL标准液使用，现用现配。（实验中每管需要1000μL，为减小实验误差，故配制大体积。）
3、 对照管样本处理：吸取0.1mL样本于1.5mLEP管中作为对照管，沸水浴5min，冷却至常温待测。
4、 加样表（在1.5mLEP管中分别加入）
试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 |
提取液 | 850 | 850 |
试剂一 | 50 | 50 |
样本 | 100 | 100（已灭活） |
混匀，置于40℃水浴锅中准确反应10min，立即沸水浴5min，冰浴冷却至常温。10000rpm，室温离心10min，取上清液待测。 |
上清液 | 50 | 50 |
提取液 | 950 | 950 |
充分混匀后测定 270nm 下的吸光度，分别记为 A 测定、A 对照，计算ΔA 测定=A 对照-A 测定。另取 1000μL 标准液于石英比色皿中，测定 270nm 处的吸光度，记为 A 标准。每个测定管需设一个 对照管。标准管只需测 1-2 次。 |
三、单宁酶活力计算
1、按蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟减少1nmol PG的酶量定义为一个酶活性单位。单宁酶（U/mg prot）=ΔA测定÷（A标准÷C标准）×1000×F×V酶促÷（V样本×Cpr）÷T
=1000×ΔA测定÷A标准÷Cpr
2、按样本质量计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟减少1nmol PG的酶量定义为一个酶活性单位。单宁酶（U/g 质量）=ΔA测定÷（A标准÷C标准）×1000×F×V酶促÷（V样本×W÷V提取）÷T
=1000×ΔA测定÷A标准÷W
3、按细胞或细菌数量计算：
单位的定义：每104个细胞或细菌在反应体系中每分钟减少1nmol PG的酶量定义为一个酶活性单位。单宁酶（U/104 cell）=ΔA测定÷（A标准÷C标准）×1000×F×V酶促÷（V样本×500÷V提取）÷T
=2×ΔA测定÷A标准
C标准：标准溶液的浓度，0.05μmol/mL；F：上清液的稀释倍数，上述反应体系中F=1mL÷0.05mL=20；1000： 单位换算系数，1μmol=1000nmol；V样本：加入的样本体积，0.1mL；V酶促：酶促反应总体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V提取：提取液体积，1mL；500：500万个细胞；T：反应时间，10min。
注意事项：
如果A测定大于1.5，可以适当加大稀释倍数，保证总体积1mL不变，如20μL上清液和980μL提取液（相当于
F=1000/20=50），计算公式中需改变F和V上清液的数值。
